MicroCal PEAQ-ITC mit organischen Lösungsmitteln: Tipps und Vorsichtsmaßnahmen

Zusammenfassung

Es gibt ein zunehmendes Interesse an Anwendungen der Isothermen Titrationskalorimetrie (ITC), die das Lösen der Bindungspartner in einem organischen Lösungsmittel erfordern. Dazu gehören Gast-Host-Chemikalienreaktionen, Nanopartikel und unlösliche Materialien. Für erfolgreiche Ergebnisse erfordert das experimentelle Protokoll mit organischen Lösungsmitteln eine geringfügige Anpassung der normalen Methoden mit wässrigen Puffern. Dieser Blog enthält Tipps zur Durchführung erfolgreicher Experimente mit organischen Lösungsmitteln auf einem MicroCal PEAQ-ITC-System.

Wenn Sie ein anderes MicroCal ITC verwenden oder weitere Fragen haben, kontaktieren Sie bitte Ihr örtliches Malvern Panalytical-Büro oder den Helpdesk.

Bevor Sie organische Lösungsmittel mit einem MicroCal PEAQ-ITC oder einem anderen MicroCal ITC-System verwenden, beachten Sie bitte folgende Warnhinweise vor jeglichen Experimenten:

• Malvern Panalytical hat nicht alle Instrumentenkomponenten mit allen organischen Lösungsmitteln getestet. Eine vollständige Liste der benetzten Oberflächenkomponenten erhalten Sie aus dem Benutzerhandbuch des MicroCal PEAQ-ITC oder Ihrem regionalen Malvern Panalytical-Büro (eine teilweise Liste befindet sich unten). MicroCal VP-ITC und iTC200 verwenden einige unterschiedliche Materialien.
• Überprüfen Sie die Chemikalienbeständigkeitshandbücher für weitere Informationen zu spezifischen Instrumentenkomponenten und Lösungsmitteln von Interesse. Es gibt mehrere Handbücher online.
• Begrenzen Sie die Zeit, in der das PEAQ-ITC organischen Lösungsmitteln ausgesetzt ist, und entfernen Sie organische Lösungsmittel nach der Verwendung vollständig. Bewahren Sie keine organischen Lösungsmittel in ITC-Zellen oder Spritzen auf. Säubern Sie verschüttete Flüssigkeiten sofort.
• Es ist möglich, dass flüchtige Gase aus Lösungsmitteln in die Instrumentenelektronik eindringen und den Zellkern beschädigen. Dies ist eine teure Reparatur.
• Verwenden Sie keine organischen Lösungsmittel mit dem PEAQ-ITC-Waschmodul oder dem Autosampler für den automatisierten PEAQ-ITC, es sei denn, das Lösungsmittel ist mit ALLEN Instrumentenkomponenten kompatibel.
• Kennen Sie die menschlichen und umweltbezogenen Risiken der organischen Lösungsmittel sowie die Präventivmaßnahmen. Verwenden Sie organische Lösungsmittel in einem gut belüfteten Labor und geeignete persönliche Schutzausrüstung. Entsorgen Sie organische Lösungsmittelabfälle auf geeignete Weise.

Hier ist eine Liste von Lösungsmitteln, die mit MicroCal PEAQ-ITC kompatibel sind:

• Wässrige Puffer zwischen pH2-pH12
• 1 M NaCl
• 50% DMSO
• 50% Acetonitril
• 100% Methanol
• 50% Ethylenglykol
• 20% Contrad 70
• 14% Decon 90

Teilliste der benetzten Oberflächenmaterialien des MicroCal PEAQ-ITC – Überprüfen Sie die Beständigkeitsführer für spezifische Lösungsmittel. Diese Liste enthält nicht alle benetzten Komponenten des Waschmoduls und alle Materialien, die im PEAQ-ITC-Autosampler verwendet werden.

• Hastelloy-Legierung C276: ITC-Zellen
• Acetal (auch Delrin genannt): ITC-Zellüberlaufbecher
• Edelstahl 316: Injektionsspritze, manuelle Zellfüllspritze, ITC-Zellports
• Edelstahl 303: Injektionsspritzenmutter
• PEEK: Füllportadapter (FPA), Waschmodul
• Kalrez: Füllportadapter (FPA)
• PTFE: Injektionspipette, Injektionsspritzenlagerhülse, manuelle Zellfüllspritze
• Borosilikatglas: Injektionsspritze, manuelle Zellfüllspritze
• Tygon 2375: Schläuche für Waschmodul und FPA-Montage
• Polypropylen: Schnellkupplungsverbindungen für Waschmodul und Füllportadapter (FPA)-Montage
• FEP (fluoriertes Ethylenpropylen): Umhüllung für manuelle Zellfüllspritze
• HINWEIS: einige organische Lösungsmittel können die 0,2-mL-Röhrchen erweichen, die verwendet werden, um die Injektionsspritze zu füllen, und den Klebstoff abbauen, der zur Montage der manuellen Zellfüllspritze verwendet wird.

Wie man Experimente mit organischen Lösungsmitteln durchführt

Probenvorbereitung mit organischen Lösungsmitteln:

• Jeder Bindungspartner für die ITC-Titration muss in demselben Lösungsmittel sein. Jede Nichtübereinstimmung aufgrund eines anderen Lösungsmittels oder Additivs führt zu einem hohen Hintergrundwärme
• Verwenden Sie trockene Lösungsmittel, die in versiegelten Ampullen geliefert werden oder mit einem Molekularsieb getrocknet wurden. Dies reduziert die Wasserkontamination während des ITC-Experiments.
• Die Probe sollte rein sein, ohne zusätzliche Materialien, Additive, Lösungsmittel usw.
• Wiegen Sie Proben sorgfältig ab und mischen Sie sie mit Lösungsmittel. Verwenden Sie sie sofort, um eine Konzentrationsänderung, Feuchtigkeitsverunreinigung usw. zu verhindern.
• Wenn Sie vor der ITC ein Lösungsmittel durch ein anderes ersetzen müssen, achten Sie darauf, das gesamte anfängliche Lösungsmittel mittels geeigneter Methode (z. B. Lyophilisierung) aus der Probe zu entfernen.
• Wenn Sie ein Mischlösungmittel verwenden (z. B. 50% Acetonitril/50% Wasser): Diese sind schwierig genau abzugleichen. Führen Sie entsprechende Kontrolltitrationen durch.
• Entgasen der Proben vor der ITC ist bei organischen Lösungsmitteln möglicherweise nicht effektiv. Achten Sie auf potenzielles Ausgasen beim Füllen der ITC-Zelle und Spritze.
• Wenn Sie ein flüchtiges Lösungsmittel verwenden, beachten Sie, dass sich die Probenkonzentrationen in der ITC-Zelle und Spritze während der Lagerung und des ITC-Experiments aufgrund der Lösungsmittelverdampfung wahrscheinlich ändern werden.

Vorbereitung der MicroCal PEAQ-ITC-Zellen und Injektionsspritze für Experimente mit organischen Lösungsmitteln

Vor dem ersten Experiment:

• Reinigen Sie die Proben- und Referenz-ITC-Zellen und die Injektionsspritze mit 20% Contrad 70 (oder 14% Decon 90), gefolgt von mehreren Wasserspülungen, um Proteine und andere Verunreinigungen zu entfernen. Wiederholen Sie die Reinigung bei Bedarf. Entfernen Sie das Wasser.
• Spülen Sie die ITC-Injektionsspritze mit Methanol und trocknen Sie sie dann mit der PEAQ-ITC-Pumpe, um das Methanol zu entfernen.
• Spülen Sie die Proben- und Referenz-ITC-Zellen mit Methanol, unter Verwendung der manuellen Zellfüllspritze. Entfernen Sie das Methanol.
• Mit leeren ITC-Zellen stellen Sie das Gerät für 30-60 Minuten auf 60°C ein, um das Methanol zu verdampfen. Dies trocknet die ITC-Zellen.
• Stellen Sie die ITC-Zellen auf die experimentelle Temperatur ein.
• Füllen Sie die Referenzzelle mit experimentellem Lösungsmittel (kein Wasser verwenden)
• Füllen Sie die Probenzelle mit der Probe im Lösungsmittel.
• Füllen Sie die Injektionsspritze mit der Probe im Lösungsmittel

Zwischen Experimenten mit demselben Lösungsmittel:

• Entfernen Sie die Probe aus der Probenzelle mit der manuellen Zellfüllspritze. Spülen Sie die Zelle mehrmals mit Lösungsmittel, unter Verwendung der manuellen Zellfüllspritze. Füllen Sie die Probenzelle mit einer neuen Probe + Lösungsmittel.
• Spülen Sie die ITC-Spritze mehrmals mit Lösungsmittel. Verwenden Sie den Füllportadapter, um die Spritze zu umgehen, und umgehen Sie das PEAQ-ITC-Waschmodul. Füllen Sie die Spritze mit Probe + Lösungsmittel.
• Ersetzen Sie das Lösungsmittel in der Referenzzelle, wenn Verdampfung aufgetreten ist.

Nach dem letzten Experiment in organischem Lösungsmittel:

• Entfernen Sie die Lösungsmittellösung aus den Proben- und Referenzzellen mit der manuellen Zellfüllspritze. Wenn das Lösungsmittel nicht mit Wasser mischbar ist, spülen Sie die ITC-Zellen mehrmals mit Methanol mit der manuellen Zellfüllspritze. Folgen Sie mit einem Wasser- und Reinigungsmittellösungsauswaschen. Spülen Sie mit Wasser und lassen Sie frisches Wasser in Proben- und Referenzzellen.
• Wenn das Lösungsmittel nicht mit Wasser mischbar ist, spülen Sie die ITC-Spritze mehrmals mit Methanol, dann Wasser und Reinigungsmittellösung. Spülen Sie mit Wasser und Methanol und lagern Sie die Spritze trocken.
• Wenn das Lösungsmittel nicht mit Wasser mischbar ist, spülen Sie die manuelle Zellfüllspritze mehrmals mit Methanol, dann Wasserlösung. Lagern Sie die Spritze trocken.
• Stellen Sie sicher, dass alle organischen Lösungsmittelverschüttungen auf dem Instrument gereinigt werden

Vorgeschlagene experimentelle Gestaltung und Kontrollversuche

• Für MicroCal PEAQ-ITC: 25 °C, 19 x 2 µL Injektionen, 150-Sekunden-Intervall, 500-750 U/min Rühren (empfohlen wird eine Rührgeschwindigkeit unter 1000 U/min für organische Lösungsmittel).
• Möglicherweise wird eine langsamere Rührgeschwindigkeit benötigt, um den geräuscharmen Grundwert zwischen Injektionen zu reduzieren, und/oder eine andere Temperatur
• Wenn sich der Grundwert verschiebt, kann dies auf Blasen in der ITC-Zelle und/oder der Spritze zurückzuführen sein
• Es ist wichtig, mehrere Kontroll-ITC-Titrationen durchzuführen, um sicherzustellen, dass die beobachteten Wärmeveränderungen auf Bindungen und nicht auf einen anderen Prozess oder Lösungsmittelabgleich zurückzuführen sind
  • Wasser in Wasser titriert: Dies ist der empfohlene Test für die allgemeine ITC-Funktion
  • Lösungsmittel in Lösungsmittel titriert
  • „Ligand/Gast“ + Lösungsmittel in ITC-Spritze, titriert in Lösungsmittel nur in ITC-Zelle
  • Lösungsmittel nur in ITC-Spritze, titriert in „Makromolekül/Host“ + Lösungsmittel in ITC-Zelle
  • All diese Kontrollversuche sollten kleine, reproduzierbare Veränderungen pro Injektion mit niedrigem Rauschen liefern
• Wenn Wärmeänderungen pro Injektion größer als erwartet für Kontrollen und/oder Experimente sind, suchen Sie nach Feuchtigkeitskontaminationsquellen und Lösungsmittelabweichungen und stellen Sie sicher, dass die ITC-Zellen und Spritze gereinigt wurden.
• Wenn es keinen Hinweis auf Bindung und/oder Sättigung der Bindung gibt, überprüfen Sie auch die Konzentrationen.

Beispiel: Host-Gast-Interaktion in Acetonitril

• Roh-ITC-Daten (oben) und Datenanpassung an ein Ein-Set-Sites-Modell (unten) für die Host-Gast-Erkennungsreaktion in Acetonitril
• „Gast“ in der Spritze bei 17,5 mM und „Host“ in der Zelle bei 0,7 mM.
• Experimente durchgeführt mit MicroCal PEAQ-ITC, analysiert mit PEAQ-ITC-Software.

Weiterführende Literatur:

• Isotherme Titrationskalorimetrie: Theorie und Praxis
• Top Ten Faktoren, die beim Kauf eines Isothermen Titrationskalorimeters zu berücksichtigen sind
• MicroCal PEAQ-ITC-Benutzerhandbuch
• MicroCal PEAQ-ITC-Betriebsanleitung