Der Weg zum Kalorimeter-Meister Vol.3: Isotherme Titrationskalorimetrie iTC – Messung und Analyse Tipps!

Nun, ich lasse es immer eingeschaltet. Das macht das System stabil. Aber jede Laboreinheit hat ihre eigenen Regeln. Sie könnten die Temperatur einen Tag vorher einstellen, zumindest aber eine Stunde vor der Messung. Wenn Sie die Basislinie stabilisieren wollen, schalten Sie das System lieber zeitgerecht ein. Vergessen Sie nicht, die Messungstemperatur einzustellen!

Verstanden. Dann wechsle ich das ultrapure Wasser im Referenzbehälter. Diese Aufgabe genügt es, einmal pro Woche auszuführen. Was tun, wenn das System länger als eine Woche nicht genutzt wird? Muss es dann trotzdem ausgetauscht werden?

Wenn es nicht benutzt wird, gibt es keinen zwingenden Grund zum Tauschen. Doch selbst Wasser entwickelt mit der Zeit Mikroorganismen. Wechseln Sie daher einmal im Monat das ultrapure Wasser in sowohl der Proben- als auch der Referenzzelle. Ist wichtig! Zellen sollten stets mit frischem, ultrapurem Wasser befüllt und beendet werden. Wenn Sie Zellen austrocknen, bleiben möglicherweise Rückstände zurück und verfestigen sich.

Verstanden! Als nächstes reinigen wir das System. Laut Handbuch verwenden wir den Befehl des Kontrollprogramms Cell and Syringe Wash und folgen den Anweisungen auf dem Bildschirm.

Ja, das geht problemlos nach Anleitung. Wenn Sie gründlicher reinigen möchten, können Sie auch andere Befehle nutzen. Die Anleitungen stehen im Handbuch, prüfen Sie die Bedeutung von jedem Befehl.

Seite 42 im Handbuch.

Für Handbuchwünsche kontaktieren Sie uns bitte hier.

Ich reinige die Zelle nach jedem Probenlauf mit 14% Decon90 oder 20% Contrad 70. Danach spülen Sie mit einer gasklaren Spritze mit ultrapurem Wasser ab. Dann füllen Sie Reinigungsmittel mit der Spritze in die Zelle. Diese schäumt schnell, also Vorsicht. Bei hartnäckigen Verschmutzungen lassen Sie die Lösung einige Minuten einwirken. Entfernen Sie das Reinigungsmittel, dann führen Sie den Cell Water Rinse (Long) einige Male durch, um jegliche Reinigungsmittel zu entfernen. Die Sauberkeit Ihrer Zelle entscheidet über die Qualität Ihrer Daten.

In Ordnung, gibt es bei der Spritzenreinigung noch Aspekte zu beachten?

Bei normaler Reinigung achten Sie nach dem Trocken-Schritt darauf, ob Wassertropfen auf dem Glasteil der Spritze oder in der Reinigungsposition zurückbleiben. Bei Rückständen besteht die Gefahr der Methanolvermischung im Probensystem. Sie sehen ein unerwartetes starkes Wärmeereignis bei Wasser-Wasser-Messung, dann ist vermutlich Methanol involviert; die Hauptursache wäre ein unzureichender Fit des Befüllportadapters.

Dieser Adapter könnte Kopfzerbrechen bereiten.

Vielleicht anfangs, aber nach 2-3 Anwendungen wird das. Apropos Spritzenreinigung, wenn bei Wasser-Wasser-Messungen ungeachtet Methanol-Fehlens Wärme auftritt, kann die Spritze kontaminiert sein; in dem Fall orientieren Sie sich am Handbuch zur Spüllösungseingabe.

Seite 42, ja. Die Spritze trocknet; ich beginne mit der Probenbefüllung. Ohne Tropfen. Für Blasenfreiheit wird die Probe auf Raumtemperatur gebracht. Blasen? Degasieren ist hier richtig?

Beim iTC200 ist Degasieren unnötig. Bei sichtbaren Blasen nutzen Sie ein leichtes Raumtemperaturschleudern.

Interessant. Befülle die Probenzelle mit EDTA, die Titrationsspritze mit CaCl₂. Weder Blasen noch Parameterprobleme! Starten! DP ist stabil, Titration beginnt.

Sehen wir uns das an.

Frau Nakamura hatte vorgesorgt und diesmal die Jackentemperatur geprüft, was die Titration prompt starten ließ. Wenn die eingestellte und tatsächliche Temperatur stark differieren, gibt es Verzögerung.

Übrigens beiläufig, Herr Professor, die Stabilität der Basislinie wird automatisiert gesteuert, steht aber im Handbuch auch manuell, was ist daran?

Die Software erlaubt Messungen fortzusetzen auch bei leichtem Driften der Basislinie. Der iTC200 besitzt hohes Signal-Rausch-Verhältnis, also minimaler Einfluss auf Resultate. Doch warum eine instabile Basislinie?

Äußere Einflüsse, wie Klimaanlagen, sind zu vermeiden? Systemheit? Was noch?

So ist es, jedoch existieren weitere Faktoren. Bei stärkerer Magnetfeldabstrahlung sind Effekte vorhanden. Klimaanlagen oder Felder lassen wellenförmiges, gleichmäßiges Driften erkennen. Ebenso können Luftblasen in Zellen Driften verursachen; vor oder während des Vorgangs eintreten. Die Syringenseite schiebt Blasen hinaus, was einen ansteigenden Basislinienverlauf erzeugt. Blasendurchgang can abrupten Anstieg bedingen.

Anfangs-DP zwischen eingestellten ±1 µcal/sec?

Ja, doch ±1 µcal/sec ist sehr milde gesetzt. Nähere Annäherung ist anzuraten. Basislinie bald stabil?

9.7 µcal/sec Bereich. Messung startete; wahrscheinlich eine Stunde, Pause?

Augenblick, Frau Nakamura. Momentan Platz lassen, leider ungeeignet.

Was!? Warum nicht!

Warten Sie zumindest bis nach der zweiten Titration.

Bis zur zweiten Titration?

DP-Wert der Baseline ok. Überprüfen Sie zwei Checkpoints.

Zwei Checkpoints!?

Erstens, ist die Referenzleistung angemessen für die Wechselwirkung? Bei Biopolymeren z.B. sollten 5 µcal/sec genügen, hier bei EDTA und CaCl₂ setzen wir 10 µcal/sec. In Titration 1 ist die Volumenklassengröße reduziert, ab der zweiten auf Normalmaß.

Notiz: In Titrationsparameterkonfigurationen ist Titration 1 auf etwa 1/5 der Haupttitration reduziert. Das stabilisiert die Basislinie, da erste Titrationsspritzen abgedünnt werden – die Startlösung weicht von der Nominalkonzentration ab. Deshalb lässt MicroCal ITC Titration 1 für den Datencheck weg, bevor der Hauptlauf beginnt.
Bezüglich Referenzleistung, vermerkt das Handbuch für EDTA-CaCl2 10 µcal/sec. Bei gemessenen Biopolymeren wie Proteinen emuliert die Anfangsreaktion bis max. -1 µcal/sec, daher reichen 5 µcal/sec. Obgleich hohe Referenzpower wählbar bleibt, ist vermehrte Zellwärme zu erwarten, was Rauschen erzeugt.

Die Referenzpower beschreibt die Heizkraft bei Wechselwirkungsmessung –10 µcal/sec garantiert. Durchbruch des nuller Y-Achsenwerts zeigt ungenügende Referenzpower, die exakt ermittelte Heizkraft verhindert.

Kann man die Referenzkalorimaße ändern?

Nein, leider nur die Injection Parameter.

Selbst bei Neusesetzen des Referenzmaßes werden Konzentrationsangaben, insbesondere Seiten, unpräzise eingestellt, wodurch neue Messungen unerlässlich sind, oder nur als Referenz zu betrachten.

Verstanden. Titration 1 ist auf kleinste dosiert, Titration 2 soll begutachtet werden. Also, noch was?

Prüfen Sie die Zeitabstände (Spacing) – jede Titrationsreaktion kehrt zur Basislinie zurück. Aufgrund der Reaktionen wird flächendeckend ihre Wärme nachgewiesen. Mangelnde Zeitabstände bewirken Basislinienrückkehr, was den flächendeckenden Nachweis beeinträchtigt; verstehen Sie?

Die aktuelle Messung … zeigt sich im Referenzleistungsrahmen und Baseline nach Rückkehr. Retrorealisierung übertrifft. Injection Parameters können effektiv umgestellt werden?

Korrekt, Frau Nakamura! Doch aufpassen, linkes Bild zeigt Baseline-Rückkehrprobleme in Fortläufen. Beachten Sie die Spacing. Aber jetzt, Pause?

Ja!

Fortsetzung folgt…