Der Weg zum Kalorimeter-Meister Vol.4
Stärken Sie Ihre Fähigkeit, ITC-Experimente zu optimieren!
Die in diesem Artikel vorkommenden Personen und Geschichten sind fiktiv.
Für technische Inhalte haben wir Unterstützung von
Herrn Fukada, Gastforscher an der Universität Osaka, erhalten.
※ Am Ende dieses Artikels können Sie Materialien herunterladen.
【Die Geschichte bisher】
Frau Nakamura von Maruban Pharmaceuticals wurde von ihrem Vorgesetzten Herr Tanaka angewiesen, das Kalorimeter zu starten. Unter der Anleitung von Herrn Fukada konnte sie die Grundlagen der Messung und Analyse mit dem iTC200 erlernen.
【Die heutige Geschichte】
Nachdem Frau Nakamura die grundlegenden Fertigkeiten erworben hatte, beschloss sie, zunächst mit den derzeit zur Verfügung stehenden Antikörper-Antigen-Messungen zu beginnen. Das Antigen ist ein gekauftes Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 50 kDa, während der Antikörper selbst hergestellt wurde. Basierend auf anderen Messergebnissen wird eine Affinität im Bereich von wenigen nM erwartet.
Laut Publikationen wird das Antigen meistens in die Spritze und der Antikörper in die Zelle gegeben. Basierend auf dem C-Wert(＊1) ergibt die Berechnung, dass bei einem KD-Wert von wenigen nM die Konzentration zu niedrig ist und mindestens 10 μM sichergestellt werden müssen. Bei einem 1:1 Bindungsverhältnis wird ein Antigen von 100 μM benötigt, jedoch sind bei zweiwertigen Antikörpern 200 μM erforderlich. Hm? Ist es auch in Ordnung, wenn ich 5 μM Antikörper und 100 μM Antigen verwende? Da ich Proben sparen möchte, möchte ich es mit einer niedrigeren Konzentration versuchen. Beginnen wir also mit einem Kontrollexperiment(＊2). Was das Tropfvolumen und die Anzahl der Tropfen betrifft, orientieren wir uns an den Bedingungen auf Seite 9 der vereinfachten japanischen Anleitung und führen 18 Tropfen zu jeweils 2 µl aus. Der erste Tropfen beträgt jedoch 0,4 µl.
※1 Eine Erklärung zum C-Wert finden Sie in Der Weg zum Kalorimeter-Meister Vol.2.
※2 Informationen zu Kontrollexperimenten finden Sie in Der Weg zum Kalorimeter-Meister Vol.3.
Fühlt sich nach viel Wärme bei der Verdünnung an? Oder ist das normal? Zunächst messe ich mal die Proben.
Es gibt kaum Änderungen im Vergleich zum Kontrollexperiment?! Der Wärmefluss zu Testende stimmt am Ende auch nicht mit der Nullüberein, und das Puffer, das ich benutze, sollte den gleichen Aufbau haben… Ist die Spritze verschmutzt? Nein, das System wurde vor der Messung überprüft, das ist unwahrscheinlich. Herr Fukada~.
Frau Nakamura, was ist los?
Tatsächlich ist es so, dass bei der Messung meiner Probe, Antigen und Antikörper, fast kein Unterschied in den beiden Datensätzen festgestellt werden konnte.
Oh, wirklich? In diesem Fall wissen wir nicht, was da gemessen wird. Haben Sie eine Ursache gefunden?
Der DP-Wert liegt bei 5 μcal/sec der festgelegten Referenzleistung, was bedeutet, dass die Zellverschmutzung ausgeschlossen ist. Ich dachte, das Probleme der Titrierung den Titrationsspritzen verschmutzt sein könnten, jedoch prüfte ich das System vor der Probemessung und es war in Ordnung. Daher glaube ich, es könnte am Puffermismatch liegen, aber ich benutze den Puffer derselben Zusammensetzung. Demnach schwer vorstellbar.
Sie haben gesagt: „dass Sie den gleichen Puffer“ verwenden? Haben Sie das Sample dialysiert?
Ja, der Antikörper ist selbst zubereitet, das Antigen ist gekauft und Carrier free. Zur Serumzubereitung des Antigens verwende ich einen Puffer mit der gleichen Zusammensetzung, wie der zur Antikörperreinigung.
Ah, aber nach der Gelreinigung keine Dialyse durchgeführt, oder? Bereiten Sie das Antigen in einem anderen Puffer bei der Gelreinigung vor?
Genau gesagt wird zur Konzentrationsvorbereitung das Antigen separat hergestellt, aber die Zusammensetzung sollte ähnlich sein.
Frau Nakamura, dann könnte doch der Puffer eine unterschiedliche Zusammensetzung haben. Auch wenn die Zusammensetzungen gleich sind, können kleine Abweichungen bei der Chemikalienmessung nicht ausgeschlossen werden. Auch Material das zum gleichen Datum ausgearbeitet wurde, kann sich mit der Zeit verändern. Außerdem, Sie verwendeten Carrier Free freeze-dried, richtig? Wurde geprüft, unter welchen Bedingungen die Formulierung durchgeführt wurde? Manchmal bleiben TFA oder Acetonitril-Rückstände, und sie können den pH-Wert beeinflussen.
Was!? Wirklich?
Um sicherzustellen, dass Zell- und Spritzenprobe so gut wie möglich zusammentreffen, ist Dialyse wichtig. Besonders für gekauftes Material, das Sie nicht selbst vorbereitet haben, ist es besser, Dialyse mit dem Antikörper zusammen zu machen, um ungewisse Faktoren auszuräumen.
Ich verstehe. Ich werde das neu messen und dialysieren. ITC ist wirklich sensibel …
Zusammengefasst, „das genaue Puffer Matching zwischen Zellprobe und Spritze“ ist sehr wichtig beim Messen mit ITC. Wenn bei Kontrollexperimenten große Wärmereaktionen auftreten oder beim Fortschreiten der Titration Veränderungen gesehen werden, kann das eine Anzeichen für ein Mismatch zwischen Ligandenlösung und Puffer sein. Natürlich, auch die Trocknung von Methanol nach der Spritzentrocknung sollte beachtet werden, nicht ausreichend getrocknetes Methanol bringt ebenfalls Probleme.
Bitte überprüfen Sie das Puffermatching vor Beginn der Experimente. Wenn bei Kontrollexperimenten trotz sorgfältigem Puffermatching noch Auffälligkeiten bleiben, könnte es sein, dass dies an der Aggregation oder Selbstassoziation im Inneren der Spritze liegt. In solchen Fällen sind eine Überprüfung der Messbedingungen notwendig.
Bei Liganden von geringem Molekulargewicht, die nicht dialysiert werden können, kann der Hochmolekularstoff nach Dialyse direkt in das Exdialysemedium eingebracht werden. Achtung ist geboten, wenn Substanzen mit Additiven oder Salzen (synthetische Peptide oder Nukleotide usw.) aufgelöst werden. Nach der Auflösung sollte der pH mit einem pH-Meter überprüft werden. Weicht der pH der Ligandenlösung um mehr als 0,05 von dem Puffer ab, ist eine leichte Anpassung mit HCl oder NaOH-Lösung nötig. Wärmereaktionen durch kleine Unterschiede in der Salzkonzentration lassen sich durch ein Kontrollexperiment berücksichtigen.
Bitte beachten Sie auch, dass bei Liganden mit Protonen-Dissoziationsstellen, die Konzentration der Pufferkomponenten nicht wesentlich unterschiedlich sein dürfen, da sonst keine ausreichende Pufferkapazität bereitsteht und der pH-Wert beeinflusst wird, selbst wenn die Konzentration der Pufferkomponenten nur wenig abweicht.
Am nächsten Tag ….
Dialyse abgeschlossen. Konzentrationsanpassung OK! Kein pH-Fehler. Proben aufgesetzt, mit der Messung beginnen!!
Die Verdünnungswärme beim Kontrollexperiment war konstant. Bei den Proben führte die spätere Messung der Verdünnung zum Schluss. Dialyse ist wirklich wichtig!! Nun zur Analyse…
Das Fitting war gut! KD war 6nM, das Bindungsverhältnis 1,8.
Frau Nakamura. Ich denke, Sie haben gute Daten erhalten.
Ja. Die Wichtigkeit der Dialyse wurde mir wieder deutlich!
Richtig. Übrigens, wie haben Sie die Kontrolldaten in diesem Fall subtrahiert?
Ich habe die Rohdaten gemäß Handbuch abgezogen.
Genau richtig.
Zusammengefasst, das Handbuch empfiehlt, die Kontrolle anhand der Rohdaten abzuziehen. Wenn die Verdünnungswärme konstant ist, kann auch der Durchschnitt im Kontrollexperiment subtrahiert werden, wenn der Lärm zu groß ist. Wählen Sie je nach Situation aus.
Dann eine Frage. Dies ist das differenzierte Kontrolldatenmaterial, aber gibt es bei der Analyse hier ein Problem? Was denken Sie?
Ist das Fitting schlecht?
Genau. Warum ist das Fitting Ihrer Meinung nach schlecht?
Ist es vielleicht das falsche Modell?
Nein, ich denke nicht, dass es das Modell ist. Welche Stelle des Fittings macht Ihnen besonders Sorgen?
Ist es der section, der zum Schluss in Plateau mündet?
Richtig. Warum meinen Sie, ist das so?
… Ich weiß es nicht.
Wenn das Fitting durchgeführt wird, berechnet die Analysesoftware, dass der Wärmeflussende zu Null konvergiert. Mit diesen Daten, ist die Plotgrafik über Null, nicht? Das rote Fitting zeigt aber Ziel am Ende Null zu erreichen.
Ach so! Wirklich?
Warum denken Sie Frau Nakamura, dass trotz des Subtrahierens der Kontrolle das Ergebnis nicht Null war?
Ist das, weil Wärmereaktionen bei der Kontrolle stärker sind, verglichen mit der Probe, und wenn es subtrahiert wird, wird es positiv? Könnte das sein?
Genau. Damit, wenn dies so ist, wie sollten wir analysieren?
Hm, ich weiß nicht.
Wenn solche Daten erhalten werden, obwohl das Subtrahieren der Verdünnungswärme nicht gelungen ist, kann dieser Trick verwendet werden: Anpassen der Rohdaten, damit die Werte nach der Sigmoidkurve gegen Null tendieren.
Ein Trick? Wie geht das?
Die Funktion Y Translate ist nützlich.
Y Translate?
Wörtlich, ein Werkzeug zur Verschiebung der Y-Achse. Sehen Sie sich die Dokumentation an.
Für Materialien zur Bedienung von Y Translate geben Sie bitte die erforderlichen Informationen in das Formular am Ende des Artikels ein und laden Sie es herunter.
Ja, danke sehr.
Man muss sich auch an die Analysesoftware gewöhnen … Gibt es noch keine detailliertere Analyseanleitung?
Ja, es gibt. 
Wir bieten umfassende Anleitungen zu Analysebeispielen. Alle Daten sind im gelieferten PC gespeichert.
Wir bieten auch Informationen zu den in der Analyse verwendeten Fitting-Methoden.
Y Translate abgeschlossen. Wird das Fitting nun besser?
Die Abweichung zwischen den Plott-Daten zum Testschaubild und dem Fitting ist kleiner geworden!
Frau Nakamura, Sie haben damit viel Verständnis gewonnen, nicht wahr?
Ja!
Frau Nakamura, welchen Puffer haben Sie diesmal verwendet?
Für die ITC-Messung habe ich Phosphatpuffer verwendet, da ich bei der Antikörperzubereitung ebenfalls Phosphatpuffer verwendete.
Interessant. Frau Nakamura, ich frage Sie, wenn der pH gleich ist, aber die Pufferzusammensetzung anders, ob wir dennoch die gleichen Daten erhalten?
Was!?
Zum Beispiel, bei gleicher pH, verwenden Sie HEPES oder Tris statt Phosphat. Dann?
Normalerweise ändern sich Experimente, wenn sich der Puffer ändert, daher denke ich, dass es Unterschiede gibt …
Richtig. Tatsächlich gibt es Tipps dazu in der vereinfachten japanischen Anleitung.
Ist das wahr?
Bitte überprüfen Sie die Pufferkomposition auf Seite 5.
Ach so. Unterschiede in der Protonenfreisetzungsenthalpie existieren im Puffer. Doch wie stark ist der Unterschied wirklich?
Möchten Sie über eine Tasse Tee mehr darüber reden? (Einzelheiten finden Sie in Fukadas Kolumne 3)
Ja! Herr Fukada! Vielen Dank!!
