Análisis de agregación de proteínas terapéuticas: Cuantificación y caracterización de partículas subvisibles (SVP)

En el análisis de agregación de proteínas terapéuticas, presentamos la razón por la cual es necesaria la cuantificación y análisis de características de SVP (Sub Visible Particle), los métodos de análisis de SVP y los resultados del análisis realizado por Malvern Panalytical, así como ejemplos de caracterización de partículas y mejora.

Contenido

• Razones para la cuantificación del agregado y caracterización de partículas
• Métodos de análisis de SVP para la cuantificación de agregados y resultados de Malvern Panalytical

• Método de análisis de SVP 1: DLS y LD para amplio rango
• Método de análisis de SVP 2: Evaluación cuantitativa de monómeros y oligómeros con SEC y AUC
• Método de análisis de SVP 3: NTA y RMM para el rango submicrón
• Caracterización de partículas para la cuantificación de agregados y casos de mejora
  • Caso 1: Mejora del proceso de producción de anticuerpos terapéuticos
  • Caso 2: Agregados de proteínas y gotas de aceite de silicona en inyectables
• Equipos analíticos relacionados de Malvern Panalytical

Razones para la cuantificación del agregado y caracterización de partículas

La agregación presente en proteínas terapéuticas, como medicamentos basados en anticuerpos, no puede ser confirmada visualmente. Por lo tanto, es necesaria una evaluación cuantitativa utilizando equipos analíticos para determinar el nivel de agregación presente.

Por otro lado, para distinguir si las partículas detectadas provienen de proteínas, aditivos (como azúcares) u otras impurezas, se requiere también la caracterización de partículas.

Estas partículas, que se encuentran entre la región visible y completamente invisible, se denominan partículas subvisibles (SVP). A continuación, se presentan los diversos análisis de SVP y los resultados del análisis de Malvern Panalytical.

Métodos de análisis de SVP para la cuantificación de agregados y resultados de Malvern Panalytical

Autoridades como la FDA promueven la evaluación de SVP con múltiples equipos. Desafortunadamente, cada método tiene pros y contras, y el análisis con un solo método conlleva el riesgo de errores. Malvern Panalytical ofrece una amplia gama de equipos para el análisis de SVP, proponiendo el método óptimo según la situación.

Además, en 2014, la FDA emitió guías sobre la «Evaluación de la inmunogenicidad de productos biofarmacéuticos», donde uno de los puntos cubiertos es la medición de agregados proteicos.

Método de análisis de SVP 1: DLS y LD para amplio rango

DLS (Difusión de luz dinámica) y LD (Difracción y dispersión láser) son métodos cualitativos pero adecuados para mostrar la distribución total de proteínas debido a su amplio rango dinámico.

El siguiente gráfico muestra la distribución del tamaño de partículas de un anticuerpo terapéutico comercializado (rojo) y un IgG de investigación (verde) utilizando DLS. El anticuerpo terapéutico exhibe una distribución más nítida, indicando que está terminado en tamaños uniformes.

Método de análisis de SVP 2: Evaluación cuantitativa de monómeros y oligómeros con SEC y AUC

Actualmente no hay un principio que cubra todo el rango para realizar evaluaciones cuantitativas. Para evaluar a partir de monómeros (aprox. 10 nm; en el caso de anticuerpos completos), existen principios como la SEC (Cromatografía de exclusión por tamaño) y AUC (Ultra centrifugación analítica).

Entre ellos, SEC permite fácilmente el cálculo del porcentaje de monómeros/oligómeros. Además, si se agrega un detector de difusión de luz, se puede determinar la diferencia de peso molecular en detalle.

Método de análisis de SVP 3: NTA y RMM para el rango submicrón

En el rango submicrón (0.1 – 1 μm), donde se dice que se encuentra una gran cantidad de SVP, la detección cuantitativa solo ha sido posible recientemente, utilizando métodos como NTA (Análisis de seguimiento de nanopartículas) y RMM (Mediación de masa resonante).

El rango submicrón es fácil de evaluar cuantitativamente debido a su gran presencia, y recientemente se ha considerado muy relevante para la inmunogenicidad. La FDA también recomienda encarecidamente su medición. El gráfico muestra resultados medidos por Arquímedes (método RMM), indicando una clara diferencia en la cantidad de SVP entre formulaciones estables e inestables.

Caracterización de partículas para la cuantificación de agregados y casos de mejora

FDA también recomienda el análisis de caracterización de partículas. Además, recomienda «al menos 2 técnicas analíticas ortogonales».
El principio de la caracterización de partículas comienza con «las partículas existen». Dependiendo de qué son las partículas detectadas, el método de mejora posterior varía.
Por ejemplo, si las partículas son de origen proteico, se debe reconsiderar la proteína o la formulación; si son fragmentos de celulosa, se debe reconsiderar los materiales de filtro o columna cromatográfica. En estos casos, los métodos de imagen junto con Raman imagen pueden permitir una caracterización de partículas que es difícil solo por la forma.

Caso 1: Mejora del proceso de producción de anticuerpos terapéuticos

Caso 2: Agregados de proteínas y gotas de aceite de silicona en inyectables

Entre los casos más comunes donde materiales no proteicos se detectan como partículas están las fórmulas de jeringuilla prellenadas, cuya presencia ha aumentado recientemente.
Las jeringas prellenadas son formulas en las que el líquido proteico se llena en una jeringuilla para su venta, y su interior suele estar revestido con aceite (como aceite de silicona) para un movimiento suave del pistón. Aunque el aceite de silicona en sí no es problemático, informes recientes sugieren que el aceite de silicona promueve la agregación de proteínas, y es necesario verificar la cantidad de cada uno.

Equipos analíticos relacionados de Malvern Panalytical

	Sistemas de medición de tamaño de partículas, potencial Zeta y peso molecular Zetasizer Estos dispositivos contribuyen a la investigación, desarrollo y control de calidad en nanotecnología, permitiendo medir tamaño de partículas, potencial Zeta y peso molecular absoluto en la serie Zetasizer. Estos sistemas altamente funcionales están diseñados para su uso con una operación sencilla incluso en la medición de aplicaciones complejas de partículas.
	Sistema de medición de tamaño de partículas mediante seguimiento NanoSight Este sistema sigue el movimiento browniano de partículas y mide cada una individualmente, proporcionando alta resolución en la distribución del tamaño de partículas y concentración.
	Sistema GPC/SEC de Detector Múltiple de alta sensibilidad y precisión OmniSEC Con un sensor mejorado para una máxima sensibilidad, este sistema mide con alta precisión y reproducibilidad incluso para muestras diluidas y de bajo peso molecular.
	Sistema de análisis de imágenes de partículas y espectroscopia Raman Morphologi 4-ID Este dispositivo de análisis es aplicable a farmacéuticos, cerámicas, baterías y productos químicos. Mide automáticamente tamaño y forma de partículas, permitiendo mediciones con diferencias significativas.

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