DSC y estabilidad de proteínas: ¿Qué significa el cambio de entalpía?

La Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) es el único método analítico que mide directamente el cambio de entalpía (∆H) de una transición térmica, como la desnaturalización térmica de una proteína, ácido nucleico u otro biopolímero.

¿Qué es ∆H?

∆H es la energía total absorbida al elevar el sistema a la temperatura T a presión constante. Para una proteína, esto significa la energía (calor) utilizada para desplegarla, y el ∆H es positivo, representando un proceso endotérmico. Esta energía está asociada con todos los movimientos atómicos y moleculares, así como con la energía de los enlaces que mantienen a la proteína en su conformación plegada. 

∆H se calcula integrando el área bajo el termograma (ver figura abajo), y se representa en calorías (o julios) por mol de proteína. A medida que la proteína es expuesta a temperaturas crecientes durante un experimento DSC, la proteína comienza a desnaturalizarse térmicamente, al romperse los enlaces no covalentes. El ∆H está relacionado con el número de enlaces necesarios para mantener la proteína en su conformación nativa (plegada).

∆H depende de cuán precisamente medimos la concentración total de proteína. Si la concentración de proteína no se determina con precisión, el valor calculado de ∆H se verá afectado.

¿Qué nos dice el valor de ∆H en la práctica?

Cuando se comparan los resultados DSC de diferentes proteínas, la proteína con mayor valor de ∆H no es necesariamente más estable que la proteína con un menor ∆H. Dado que ∆H está normalizado por la concentración molar total de proteína, el valor a menudo será proporcional al tamaño de la proteína. La mayoría de las proteínas tienen la misma densidad de enlaces (enlaces por volumen). Es razonable esperar que una proteína con un mayor peso molecular también tenga un ∆H mayor.

∆H depende del porcentaje de proteína nativa en solución

Una consideración importante es que DSC solo mide el valor de ∆H para la proteína que está inicialmente en su conformación plegada (nativa). La magnitud de ∆H depende de la concentración de la fracción plegada. Si la fracción inicial de proteína plegada es menor del 100% de la concentración total de proteína, el valor calculado de ∆H será correspondientemente menor.

La figura abajo muestra termogramas DSC para la misma proteína, medidos en diferentes momentos durante el almacenamiento. El termograma azul es para la proteína recién preparada que es 100% proteína nativa (plegada). A medida que la muestra de proteína se deteriora durante el almacenamiento, la fracción de proteína nativa en la solución comienza a disminuir, resultando en una disminución de la entalpía en los termogramas DSC. Podemos usar los valores relativos de ∆H de los diferentes termogramas para estimar la fracción de proteína plegada para cada muestra, cuando tenemos un termograma DSC de referencia con 100% de proteína nativa.

En este ejemplo, el ∆H para la muestra con el termograma verde tiene el 50% del ∆H de la muestra azul, por lo que es 50% proteína plegada. La muestra naranja tiene 25% de proteína plegada, y la muestra roja tiene 10% de proteína plegada, en relación con el termograma azul.

Entalpías calorimétrica y de van’t Hoff

Hasta ahora en este blog hemos hablado sobre la entalpía «calorimétrica» que se mide directamente con DSC y que a menudo se representa como ∆H_cal. Hay otro tipo de entalpía que podemos calcular a partir de los datos DSC, la entalpía de van’t Hoff – ∆H_vH. Este valor está disponible del ajuste del modelo No Dos Estados de DSC. ∆H_vH es también la entalpía que se determina a partir de cualquier técnica de fusión térmica no calorimétrica (indirecta), como el dicroísmo circular.

Con DSC, ∆H_cal se determina solo por el área bajo un pico de transición, mientras que ∆H_vH se determina solo por la forma del pico de transición. Cuanto más aguda sea la transición, mayor será ∆H_vH y viceversa. ∆H_cal depende de la concentración, pero H_vH no. 

Normalmente, una relación ∆H_cal /∆H_vH igual a 1 se considera una indicación de que la transición estudiada se ajusta al mecanismo de desplegamiento de dos estados. Una relación ∆H_cal /∆H_vH mayor que uno indica la presencia de intermediarios significativamente poblados; y una relación ∆H_cal /∆H_vH menor que uno indica interacciones intermoleculares.

Usando la relación ∆H_cal /∆H_vH, podemos estimar que una gran fracción de la proteína está inactiva. Si tenemos una proteína simple de un solo dominio, y asumimos que no hay intermediarios, se puede esperar que su desplegamiento tenga una relación de ∆H_cal /∆H_vH no muy alejada de 1. Entonces, un ∆H_cal significativamente menor que el ∆H_vH, puede indicar que una gran fracción de la proteína ya está inactiva. 

Para resumir, el análisis DSC de los datos ∆H puede proporcionar conocimientos sobre el mecanismo de desplegamiento de las proteínas y cuánto de la proteína está en su conformación nativa.

Lecturas adicionales

• Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC): Teoría y práctica
• Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) para el Desarrollo Biofarmacéutico: Versatilidad y Poder
• El Poder del Calor: Profundizando con Calorimetría Diferencial de Barrido para Estudiar Características Clave de Proteínas