Cómo la concentración de muestra puede afectar la forma del pico en los datos de OMNISEC
Hay muchos factores que pueden afectar la calidad de tus datos GPC/SEC de OMNISEC. Estos incluyen cosas como métodos de análisis, fase móvil y conjunto de columnas, pero también pueden incluir parámetros menos obvios como la concentración y el volumen de inyección.
Menciono la concentración y el volumen de inyección juntos porque ambos influyen en la masa de muestra introducida en el sistema. Una inyección de 100 µL de una muestra de 2 mg/mL carga la misma cantidad de muestra que una inyección de 50 µL de una muestra de 4 mg/mL. Es importante recordar esto si estás tratando de optimizar las condiciones de análisis, ya que puedes usar la misma muestra preparada y simplemente ajustar el volumen de inyección en lugar de preparar múltiples muestras a diversas concentraciones.
¿Cuál es la concentración ideal para mi muestra?
Como ocurre con muchas cosas en GPC/SEC, la respuesta depende de tu muestra y sistema. Un rango general de concentración de muestra es 3-5 mg/mL; es lo que busco cuando analizo muestras por primera vez. Si tienes un conjunto de columnas con muchas columnas (más de tres), entonces puede que necesites inyectar más muestra de lo esperado, ya que cada columna diluye la cantidad de muestra que pasa por los detectores en cualquier momento dado. Sin embargo, si estás analizando una muestra que sabes tiene un peso molecular muy alto, entonces probablemente necesitarás usar una concentración inferior al rango sugerido de 1-5 mg/mL.
Quieres inyectar suficiente muestra para obtener buenas señales de detector, pero también debes asegurarte de no sobrecargar el conjunto de columnas, lo que puede resultar en una cromatografía inusual. Para mí, una concentración de muestra ideal carga la menor cantidad de muestra necesaria para obtener respuestas confiables en todos los detectores.
¿Cómo puedo saber si estoy sobrecargando el conjunto de columnas?
¡Esa es una gran pregunta! La pista más notable es la forma de tu pico de muestra.
En la imagen a continuación, he incluido un cromatograma multi-detector de una muestra que muestra un pico de muestra con un hombro. Esto por sí mismo no es necesariamente una razón para preocuparse; esa forma podría representar con precisión la distribución de peso molecular de la muestra.
Sin embargo, si esperabas que tu muestra poseyera una distribución más gaussiana, entonces podrías sospechar que algo no está del todo bien. Lo primero que haría en esta situación es inspeccionar la magnitud de cada pico, especialmente la señal del índice de refracción (RI) (que corresponde directamente a la concentración de la muestra).
En el ejemplo anterior, la altura del pico de RI es mayor que 400 mV. Al igual que la forma del pico, esto por sí mismo no es necesariamente un problema. Pero indica que hay espacio para que la concentración de la muestra (o el volumen de inyección) se reduzca sin volverse indetectable. Esto también se aplica a los otros detectores.
Por lo tanto, para determinar si la muestra está sobrecargando el conjunto de columnas, se preparó una serie de diluciones de la muestra para analizar la muestra a concentraciones más bajas y monitorear cualquier cambio en la forma del pico.
Serie de diluciones
Además del análisis original, se realizaron tres análisis a concentraciones más bajas. Los cromatogramas RI de esas inyecciones se superponen a continuación.
Como se esperaba, la magnitud del pico de muestra disminuye con cada dilución. Y junto con la primera dilución ocurre un cambio en la forma del pico: ¡el hombro desaparece! Esto sugiere que la concentración de la primera inyección era demasiado alta para el conjunto de columnas, y una vez que se redujo, la muestra pudo separarse adecuadamente y se observó la distribución gaussiana esperada.
Gráfico Mark-Houwink
Para confirmar que la estructura de la muestra no estaba cambiando con la concentración, se examinó el gráfico de Mark-Houwink de las cuatro inyecciones, mostrado a continuación.
La mayoría de todos los gráficos se superponen bastante bien, indicando una estructura consistente. La linealidad de los gráficos es la esperada para polímeros sintéticos y lineales donde el peso molecular (longitud de cadena) y el tamaño molecular aumentan a tasas constantes en relación uno con el otro.
El gráfico de la primera inyección con el hombro, mostrado en rojo, presenta un codo en la región de bajo peso molecular, muy probablemente resultado de la cromatografía comprometida.
Concentración ideal
Como mencioné anteriormente, creo que la concentración ideal es la mínima concentración necesaria para obtener respuestas confiables en todos los detectores. El cromatograma multi-detector de la última inyección en la serie de diluciones, mostrado a continuación, proporciona señales fuertes para todos los detectores sin ninguno de los hombros. Esta concentración es aproximadamente una cuarta parte de la concentración original.
Reflexiones finales
En conclusión, espero que este examen de la concentración y sus efectos sobre la forma del pico te ayuden a convertirte en un usuario más competente de OMNISEC. Si tienes alguna pregunta, no dudes en contactarnos o enviarme un correo electrónico directamente a kyle.williams@malvernpanalytical.com.
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