3 formas de analizar datos de GPC/SEC

Obtener datos de calidad de GPC/SEC es solo la mitad de la batalla.  Una vez que se tienen los datos en mano, necesitas una forma de convertir esos cromatogramas en valores numéricos significativos, como el peso molecular.  Hay múltiples formas de hacerlo, dependiendo de qué combinación de detectores tengas disponible.  Esta publicación discutirá los tres métodos de análisis de datos de GPC/SEC más comunes (¡todos disponibles con OMNISEC!): calibración convencional, calibración universal y multidetección con dispersión de luz. 

Para una presentación en video que incluye el material siguiente (¡y más!) por favor ve mi video Introducción a GPC/SEC en 30 minutos.

Calibración convencional

La configuración más simple de GPC/SEC es un sistema de un solo detector, usando una bomba, un conjunto de columnas y un detector de índice de refracción (RI) o UV.  Uno de estos detectores se elige porque responden directamente a la concentración de la muestra, lo que es importante para calcular los momentos de peso molecular, como Mw y Mn.  Para obtener valores de peso molecular de una calibración convencional (a veces llamada calibración de columna), se debe ejecutar una serie de patrones bien caracterizados.  Estos patrones se utilizan para generar una curva de calibración que mapea qué peso molecular (peso molecular de pico o Mp) corresponde a cada volumen de retención, como se ilustra en la figura a continuación.

Cuando se analiza una muestra desconocida, el peso molecular de cada segmento de datos se determina en función de su volumen de retención y el peso molecular correspondiente en la curva de calibración en uso.  Dado que los valores de peso molecular obtenidos usando calibración convencional dependen de los patrones utilizados para generar la curva de calibración, los resultados para una muestra se describen como valores de peso molecular relativos.

La ventaja de la calibración convencional es que es la configuración de GPC/SEC más económica, con menos componentes y cálculos más simples.  La desventaja es que los valores de peso molecular obtenidos podrían no reflejar con precisión tus muestras si la estructura molecular, y por tanto la forma y tamaño, de tus muestras es diferente de la de tus patrones.  Y con un sistema de un solo detector, los datos calculados podrían no representar las características reales de tu muestra e incluso podrían desviar tu investigación.  En otras palabras, podrías estar en una situación donde no sabes lo que no sabes. 

¡Ve la calibración convencional en acción con OMNISEC!

Calibración universal

La adición de un detector de viscosímetro a un detector de concentración (a menudo un detector RI) permite aplicar una curva de calibración universal a una muestra desconocida.  Además de los momentos de peso molecular, se pueden determinar otros parámetros moleculares como viscosidad intrínseca (IV), radio hidrodinámico (Rh) y parámetros de Mark-Houwink. 

La respuesta del detector de viscosímetro se ve afectada por la estructura molecular de la muestra; más específicamente, su forma en solución.  Por lo tanto, la presencia del viscosímetro tiene en cuenta las diferencias estructurales entre los patrones utilizados para generar la curva de calibración y las muestras bajo análisis, proporcionando en última instancia datos más precisos que los obtenidos de la calibración convencional.

En 1967, Benoit et. al. usaron la relación entre volumen hidrodinámico, peso molecular y viscosidad intrínseca (ecuación anterior) para mostrar que la curva de calibración para polímeros de diferentes tipos puede fusionarse en una sola curva de calibración.  Recuerda que GPC/SEC separa en función del tamaño molecular o volumen hidrodinámico.  Por lo tanto, si pensamos en el volumen de elución como esencialmente volumen hidrodinámico, podemos graficar peso molecular por viscosidad intrínseca frente a volumen hidrodinámico.  Esto significa que todos los polímeros, independientemente de su estructura y forma, caerán a lo largo de la misma curva de calibración universal, como se muestra en la imagen a continuación.

La ventaja de la calibración universal es que puedes obtener valores precisos de peso molecular para tus muestras independientemente de los patrones que tengas disponibles.  Además, la inclusión de un detector de viscosímetro ofrece más datos de caracterización, incluyendo IV, Rh y parámetros de Mark-Houwink.

Sin embargo, aunque la identidad de los patrones no importa, todavía se requiere una curva de calibración y por lo tanto, cada sistema GPC/SEC tendrá una curva de calibración única.  Parámetros como columnas, fase móvil, velocidad de flujo y temperatura todavía afectarán la curva de calibración resultante.

¡Ve la calibración universal en acción con OMNISEC!

Análisis multi-detector con dispersión de luz

A veces llamado Triple Detección, Detección Avanzada, SEC-MALS, entre otros, este método utiliza un detector de dispersión de luz en combinación con un detector de concentración, como mínimo, para calcular el peso molecular absoluto.  Esto funciona porque la intensidad de la luz dispersada está relacionada con el peso molecular de una muestra.  Los detectores de viscosímetro y/o UV-Vis se añaden con frecuencia para crear una herramienta analítica de multi-detector poderosa. 

Como se describe en detalle en esta publicación sobre GPC/SEC multi-detector, cada detector responde a un aspecto diferente de la muestra, lo que permite el cálculo de peso molecular absoluto (preciso y no dependiente de una curva de calibración), IV, Rh, Rg, parámetros de Mark-Houwink, concentración, y potencialmente datos de ramificación y análisis composicional.  Las ecuaciones que rigen la respuesta de cada detector se muestran a continuación.

Además de proporcionar peso molecular absoluto, la multi-detección con un detector de dispersión de luz es ventajosa porque no depende de una curva de calibración.  El proceso de calibración simple implica ejecutar un patrón estrecho único, tan a menudo como lo consideres necesario.  Recomendamos verificar la calibración con un estándar de verificación… ¡pero eso es todo! 

Una vez que tengas un método calibrado, calcular datos para tus muestras es fácil – ¡compruébalo con OMNISEC en el video a continuación!

Reflexiones finales

En conclusión, espero que esta publicación te ayude a diferenciar entre los tres métodos de análisis comunes disponibles para datos de GPC/SEC.  Hay ventajas en cada uno de ellos, pero la precisión y conveniencia de la multi-detección con dispersión de luz la destaca de los demás como el método ideal para analizar datos de GPC/SEC.  Si tienes alguna pregunta, no dudes en contactarnos o envíame un correo electrónico directamente a kyle.williams@malvernpanalytical.com.

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