¿Cómo funciona el GPC/SEC de múltiples detectores?

por Kyle Williams, Thursday, 20th June 2019

Ya sean tus muestras polímeros sintéticos, materiales naturales como polisacáridos, o proteínas, anticuerpos u otras muestras biológicas, la permeación en gel / cromatografía de exclusión por tamaño (GPC/SEC) es la técnica ideal para caracterizar estos y otros tipos de macromoléculas. La información que ofrece el análisis de GPC/SEC incluye el peso molecular (MW), tamaño molecular en forma de radio hidrodinámico (Rh) y radio de giro (Rg), viscosidad intrínseca (IV), concentración, análisis composicional, y datos de ramificación, entre otros parámetros. Los datos disponibles dependen de la combinación de detectores presentes, ya que varios detectores se combinan para ofrecer diferentes piezas del rompecabezas de la caracterización. Esta publicación desglosará cómo los diferentes detectores, disponibles en las plataformas OMNISEC y Viscotek TDA, funcionan juntos para proporcionar una caracterización completa de una muestra. Para más detalles (¡y ecuaciones!), por favor revisa nuestro documento técnico sobre los principios del GPC/SEC de múltiples detectores.

Las relaciones entre los detectores y los parámetros moleculares se resumen gráficamente en la figura arriba. El gráfico comienza en la parte inferior con el atributo de la muestra medido directamente por cada detector, luego se mueve hacia arriba a valores que se calculan directamente de las respuestas de los detectores observadas y termina en la parte superior con la información calculada a partir de los datos calculados directamente.

Los cuatro detectores más comúnmente asociados con un sistema GPC/SEC de múltiples detectores completamente equipado son un detector de índice de refracción diferencial (RI), un detector de dispersión de luz (RALS/LALS o MALS), un detector de viscosímetro diferencial, y un detector UV. La característica específica de una muestra a la que responden estos detectores se lista en la fila inferior de la figura arriba. El detector RI responde al cambio en el índice de refracción entre la solución de la muestra y el solvente en blanco. El detector de dispersión de luz responde más intensamente al peso molecular de una muestra, las muestras de mayor peso molecular provocan una respuesta más intensa. La señal del detector de viscosímetro diferencial se basa en la diferencia en la viscosidad de la solución de la muestra en comparación con el solvente en blanco. Y la respuesta del detector UV se basa en el nivel de absorbancia de la muestra. Una muestra sin un cromóforo que no absorba luz UV no produce señal UV.

Todos los sistemas GPC/SEC deben tener al menos un detector de concentración, independientemente de los otros detectores presentes. Los detectores RI y UV se consideran detectores de concentración porque sus respuestas son directamente proporcionales a la concentración de la muestra. La mayoría de los sistemas utilizan un detector RI ya que no todas las muestras son activas en UV. Con el conocimiento del valor dn/dc de una muestra, o incremento del índice de refracción, se puede calcular la concentración exacta de una muestra en cada rebanada de datos a partir del detector RI. De la misma manera, si se utiliza un detector UV, el conocimiento del valor dA/dc de la muestra, que está relacionado con su coeficiente de extinción molar, permitirá calcular la concentración de la muestra en cada rebanada de datos. Con ambos detectores RI y UV, se puede determinar la composición de una muestra compuesta de dos componentes.

Conocer la concentración exacta de la muestra en cada rebanada de datos registrada es crítico, ya que es necesario para determinar el peso molecular y la viscosidad intrínseca, dos de los parámetros moleculares prominentes incluidos en la sección calculada directamente del gráfico jerárquico anterior. Un examen de las ecuaciones que gobiernan las respuestas de los detectores listados arriba revela por qué la concentración de la muestra es esencial. Si nos enfocamos en la ecuación de dispersión de luz, se observa la salida del detector, el KLS representa la constante del detector obtenida al analizar un estándar estrecho, el peso molecular es desconocido, el valor dn/dc es conocido ya que se usa en la ecuación para el detector RI para calcular la concentración, que luego se inserta en la ecuación de dispersión de luz, y el volumen de inyección es conocido ya que lo establece el usuario. Eso deja al peso molecular como el único desconocido. A través de la combinación de detectores RI y de dispersión de luz, el peso molecular de una muestra se puede calcular en cada rebanada de datos. Los pesos moleculares calculados se integran sobre el pico de muestra definido y los momentos del peso molecular se calculan en base a las concentraciones relativas de cada fracción.

Un proceso análogo ocurre con los detectores RI y de viscosímetro para calcular directamente el IV de la muestra en cada rebanada de datos y producir un valor promedio ponderado de IV.

Pasando de los datos calculados directamente en el medio, el nivel superior del gráfico jerárquico muestra que el peso molecular y el IV de una muestra se pueden combinar para calcular indirectamente los parámetros que ofrecen una visión de la estructura molecular de la muestra.

El tamaño de una muestra es típicamente segundo después del peso molecular en términos de la frecuencia de datos de caracterización buscados, y Rh es el parámetro de tamaño más adecuado para todos los tipos de muestras. Debe tenerse en cuenta que Rg se puede calcular desde un detector de dispersión de luz con al menos dos ángulos y un detector de concentración (de ahí su ubicación en el nivel medio), sin embargo, la muestra necesita ser lo suficientemente grande como para exhibir dependencia angular. Muchas muestras, incluidas las proteínas, no son lo suficientemente grandes para hacerlo, por lo que el Rg no se puede calcular para estas muestras. En cambio, Rh se puede calcular siempre que haya datos de un detector de concentración, un detector de dispersión de luz y un detector de viscosímetro suficientes para producir datos de peso molecular e IV. El Rh representa el radio de la esfera teórica ocupada por una muestra con el peso molecular e IV calculados. Dado que el IV se describe en términos de dL/g, o volumen dividido por masa, se puede combinar con el término de masa del peso molecular para calcular un volumen teórico para la muestra. Se aplica un modelo esférico basado en (4/3)πr3 para determinar r, que finalmente es el Rh de la muestra.

Los parámetros de Mark-Houwink (MH) se calculan a partir del gráfico MH, que traza la IV de la muestra contra su peso molecular para proporcionar una representación visual de la relación entre ambos. Estos gráficos MH usan datos adquiridos por tres detectores (concentración, dispersión de luz y viscosímetro) y pueden ilustrar cambios en la estructura molecular dentro de una sola muestra o resaltar diferencias entre múltiples muestras. Un uso frecuente de estos gráficos es identificar y cuantificar la extensión de la ramificación dentro de la distribución de una muestra.

El análisis de GPC/SEC de múltiples detectores ofrece un rango de datos de caracterización sobre varios aspectos de una muestra al emplear una serie de detectores que miden diferentes parámetros moleculares. Con un conjunto completo de detectores operando en conjunto, el resultado es una colección de datos que equivale a mucho más de lo que estaría disponible con un sistema de un solo detector. A través de las mediciones directas de los detectores individuales, ciertos parámetros se pueden calcular directamente. Y a partir de eso, el software puede obtener además datos calculados indirectamente, culminando en información que ofrece una visión estructural de la muestra. ¡Todo eso a partir de una sola inyección de tu muestra!

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