Rh o Rg: ¿Cuál es mejor para mis muestras de GPC/SEC?

El objetivo principal al emplear cromatografía por permeación en gel / cromatografía de exclusión por tamaño (GPC/SEC) es a menudo determinar el peso molecular de una muestra macromolecular. Los sistemas de múltiples detectores, como los sistemas OMNISEC y TDAmax de Malvern Panalytical, son capaces de ofrecer una gama de otros parámetros de caracterización molecular, incluyendo el tamaño molecular. En algunas situaciones, como el análisis de proteínas u otras muestras donde el peso molecular ya es conocido, el único propósito del análisis es determinar el tamaño molecular de la muestra. En estos casos, el tamaño molecular puede revelar información crítica sobre la estructura molecular de la muestra, que a menudo está estrechamente relacionada con su función o aplicación final.

Existen dos medidas comunes de tamaño molecular disponibles a través del análisis GPC/SEC: radio hidrodinámico (Rh) y radio de giro (Rg). Una entrada anterior describe cómo se utilizan Rh y Rg en la caracterización de proteínas utilizando dispersión de luz dinámica (DLS) y dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS). Esta entrada discutirá las definiciones de Rh y Rg, cómo se calculan ambos en un contexto de GPC/SEC, y las implicaciones prácticas de esas diferencias. Para más detalles (¡y más ecuaciones!) sobre los temas aquí discutidos, por favor consulte estos documentos enlazados.

Definiciones de Rh y Rg

Sin entrar demasiado en matemáticas (todavía), el Rh de una muestra es el radio de una esfera teórica que posee la misma masa y densidad que se calcula para la muestra a partir de su peso molecular y viscosidad intrínseca. El Rg representa la distancia media cuadrática de los componentes de la molécula desde el centro de masa de la molécula. Los valores únicos de Rh y Rg generados por un análisis de GPC/SEC son los valores promedio ponderados obtenidos a partir de compilar los valores calculados en cada segmento de datos. Similar al peso molecular promedio ponderado (Mw), estos valores son los más apropiados para caracterizar la muestra como un todo. Cabe señalar que un detector de dispersión de luz a múltiples ángulos (MALS) desconectado de un instrumento GPC/SEC que funciona en modo batch proporciona el valor promedio z de Rg, Rgz.

Cómo se calculan Rh y Rg

Ahora, entraremos un poco en las matemáticas. Basado en el modelo de Einstein que describe la viscosidad de una solución de partículas esféricas, la relación entre Rh, peso molecular (M) y viscosidad intrínseca ([η]) se muestra a continuación (N_A es el número de Avogadro).Dado que GPC/SEC calcula directamente el peso molecular y la viscosidad intrínseca en cada segmento de datos, el Rh puede determinarse fácilmente usando esta ecuación. Por lo tanto, el límite inferior del cálculo de Rh se alinea con la fracción de muestra más pequeña para la cual hay suficiente respuesta del detector en los canales de índice refractivo (RI), dispersión de luz y viscosímetro.

Para calcular Rg a partir de GPC/SEC hay dos opciones. El método directo y más común es observar el cambio en la intensidad de la luz dispersada respecto al ángulo de observación. Esto requiere un detector de dispersión de luz con al menos dos ángulos para observar la dependencia angular de la muestra.

Como se mencionó en la discusión previa sobre Rh y Rg y en una entrada más reciente acerca de detectores de dispersión de luz, es difícil determinar Rg para proteínas usando GPC/SEC ya que las proteínas generalmente son más pequeñas que 10-15 nm y, por lo tanto, son dispersores isotrópicos, es decir, dispersan la luz por igual en todas las direcciones. Los polímeros de bajo peso molecular también son dispersores isotrópicos lo que significa que el gráfico parcial de Zimm resultante es plano con una pendiente de cero, por lo tanto, Rg no puede determinarse para estos materiales más pequeños. Esto se muestra a la izquierda en la Figura 1, arriba.

Para que se calcule Rg mediante dispersión de luz, la molécula debe mostrar dependencia angular, lo que significa que la intensidad de la luz dispersada varía con el ángulo de observación. Esto resulta en un gráfico parcial de Zimm con pendiente, ilustrado por el ejemplo mostrado a la derecha en la Figura 1. La longitud de onda de la luz utilizada en el detector de dispersión de luz afecta el umbral de tamaño al que una muestra muestra dependencia angular, por lo que es posible que Rg se pueda calcular para rangos de tamaño más pequeños ajustando la longitud de onda de la fuente de luz.

Una forma alternativa de calcular Rg es utilizando la ecuación de Flory-Fox, que se muestra a continuación, la cual relaciona el peso molecular (M) y la viscosidad intrínseca ([η]) con Rg (Φ₀ se trata como una constante).La ventaja de calcular Rg de esta manera es que, al igual que Rh arriba, el límite inferior del cálculo depende de la respuesta del detector en lugar de si la muestra muestra dependencia angular. La desventaja es que el término Φ₀ en realidad depende de la muestra, el solvente y la estructura molecular resultante bajo estudio (es más apropiado para espirales aleatorias), y por lo tanto establecerlo como constante introduce un nivel de aproximación. En general, y para el resto de esta publicación, cuando se discute Rg se calcula a partir de un detector de dispersión de luz.

Diferencias en los datos de Rh y Rg

Los datos de Rh y Rg disponibles para un análisis dado dependen de la muestra específica en investigación. Dado que el cálculo de Rg requiere que una molécula muestre dependencia angular, si una muestra es un dispersor isotrópico que no exhibe dependencia angular, existe la posibilidad de que Rg no pueda determinarse. Una muestra con una distribución amplia de peso molecular y tamaño molecular podría poseer grandes fracciones que muestran dependencia angular y fracciones más pequeñas que no lo hacen. En este caso, Rg solo se puede calcular para las moléculas más grandes que eluyen primero.

Un ejemplo que destaca este comportamiento se muestra en la Figura 2. Las partes de los datos en las que los valores de Rh y Rg se calculan directamente están representadas por los segmentos sólidos de las curvas verde oscuro y magenta, respectivamente. Las porciones punteadas de las líneas indican las regiones donde los valores de Rh y Rg son extrapolados. El valor más pequeño de Rg que se puede calcular para la muestra es 11,55 nm, que representa el punto en el cual las fracciones de la muestra que eluyen más tarde son demasiado pequeñas para mostrar dependencia angular. Esto deja a Rg para ser extrapolado en una gran sección de esta muestra. En contraste, Rh se puede calcular hasta 5,08 nm, lo que permite que el tamaño molecular de la mayor parte de la muestra se calcule directamente.

Dado que Rh y Rg representan propiedades separadas de la muestra, no se debe esperar que los valores resultantes sean iguales. ¡Esto no significa que alguno de ellos sea erróneo! Para un tipo de muestra y solvente dado, probablemente habrá una relación consistente entre los dos. En mi experiencia con muestras poliméricas (ya que es difícil obtener datos de Rg para proteínas), el Rg calculado está en el mismo orden pero un poco más grande que el Rh determinado (en el ejemplo de la Figura 2 Rh = 13,62 nm; Rg = 14,19 nm). Esto no tiene que ser cierto en todos los casos, ya que la relación entre Rh y Rg depende de la estructura molecular.

El tamaño molecular es importante para los científicos por diversas razones. Te animo a que uses los datos disponibles de la manera más apropiada para tus muestras. Y la próxima vez que estés presentando datos de GPC/SEC y alguien pregunte sobre las diferencias entre Rh y Rg, ¡estarás preparado!

Blogs anteriores:

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