El camino hacia el maestro del calorímetro Vol.3: ¡Puntos clave para la medición y el análisis del calorímetro de titulación isotérmica iTC!

Los personajes y la historia que aparecen aquí son ficticios.
En cuanto a los aspectos técnicos, hemos contado con el asesoramiento del Dr. Fukada, investigador visitante de la Universidad Prefectural de Osaka.

【Historia hasta ahora】
La señora Nakamuara de Maruban Seiyaku recibió la orden de poner en marcha un calorímetro por parte de su supervisor, el Sr. Tanaka, pero fue un desafío tras otro. Con el deseo de profundizar su comprensión, se dirigió al Dr. Fukada para verificar los puntos pendientes.
Abordando cada problema uno por uno, profundizará su comprensión sobre el fenómeno del ITC y sus razones.
Dr. Fukada, por ahora voy a intentar realizar todas las operaciones, ¡así que por favor guía conmigo!

Sí, entendi, vamos a intentarlo.

el sistema esta encendido. ¿Cuánto tiempo debería haber estado encendido?

Bueno, yo lo mantengo siempre encendido. Así el sistema se mantiene estable. Sin embargo, creo que hay reglas diferentes en cada laboratorio, por lo que sería recomendable establecer la temperatura el día anterior o al menos encenderlo una hora antes. Si quieres que la línea base sea estable, enciéndelo con antelación. Por supuesto, no olvides establecer la temperatura de medición.

Claro. A continuación, cambiaré el agua ultrapura de referencia. Esta operación debe realizarse una vez a la semana, ¿verdad? ¿Qué sucede si no planeo usar el sistema durante más de una semana? ¿Aún debo cambiarla?

Si no planeas usarlo, no es necesario cambiarlo deliberadamente. Sin embargo, como el agua es agua, podrías no saber qué puede crecer si la dejas así, por lo que es recomendable cambiar el agua ultrapura de las celdas de muestra y referencia una vez al mes. ¡Importante, asegúrate siempre de finalizar la medición con agua ultrapura fresca en las celdas! Si secas las celdas, si quedan manchas, podrían adherirse mucho.

Lo entendí. Luego viene la limpieza del sistema. Según el manual, se dice que se deben usar los comandos del software de control. Al elegir Lavado de Celda y Jeringa aparece la guía en pantalla, así que puedo seguir las instrucciones, ¿verdad?

Así es. No hay problema si sigues las instrucciones. Sin embargo, si quisieras realizar una limpieza más meticulosa, puedes usar otros comandos también. Creo que el significado de cada comando está en el manual, así que revísalo.

La página 42 del manual.

Para solicitar el manual, por favor contáctenos aquí.

Yo, después de una medición, lavo la celda siempre con un detergente, específicamente 14% Decon90 o 20% Contrad 70. Después de quitar la muestra de la celda tras la medición, la enjuago con agua ultrapura usando una jeringa gas-tight. Luego lleno la celda con detergente usando una jeringa gas-tight. Hay que tener cuidado porque hace espuma fácilmente. Si parece que la muestra está bastante sucia, quizás sea bueno dejar el detergente por algunos minutos. Después de quitar el detergente, repito el enjuague Enjuague Largo de Celda con Agua varias veces para eliminar todo el detergente. Dejar las celdas lo más limpias posibles es clave para obtener buenos datos.

Ya veo. Entonces, ¿hay algo que deba tener en cuenta al lavar las jeringas?

Al lavar normalmente, asegúrate de revisar la parte de vidrio de la jeringa y la posición de limpieza para ver si hay gotas de agua al completar el paso de secado. Si quedan gotas, puede que el secado no sea suficiente y metanol se filtre a la muestra de la jeringa. Por ejemplo, si ves una reacción exotérmica mientras estás realizando una medición de agua-agua, significa que probablemente hay metanol. La causa principal podría ser una mala instalación del adaptador del puerto de llenado.

Estoy preocupado por este adaptador hasta que me acostumbre a él.

Puede ser, pero creo que te acostumbrarás después de usarlo un par de veces. Además, otro punto sobre la limpieza de la jeringa. Incluso si no hay metanol residual, si ocurre una reacción térmica en una medición de agua-agua, tal vez la jeringa de titulación esté sucia. El manual también menciona esto, así que intenta limpiarla con detergente de acuerdo a las instrucciones.

42 del manual, ¿verdad? Parece que el secado de la jeringa se completó, ¡así que llenaré la muestra! Sin gotas, por supuesto. Para evitar burbujas en la muestra, es necesario regresarlas a la temperatura ambiente con anticipación. Si hay burbujas a este punto, deberían desgasificar, ¿verdad?

En el caso del iTC200, las burbujas no importan mucho. Pero claro, cualquier burbuja visible debería tratarse. Usando una ligera centrifugación a temperatura ambiente para eliminarlas podría ser suficiente.

Entendido. Entonces, llené la celda de muestra con EDTA y la jeringa de titulación con CaCl₂. ¡Sin burbujas entre la punta del émbolo! Parámetros correctos. ¡Empieza! Una vez estable a DP, la titulación comienza.

Bien, observemos.

Esta vez, el Sr. Nakamura ajustó con antelación el valor de la temperatura del chaleco que olvidó la última vez, por lo que la jeringa comenzó a girar rápidamente. Si la temperatura de medición y la real se encuentran alejadas, la jeringa no comienza inmediatamente, así que ten cuidado.

Por cierto, profesor. El manual aclara que el sistema puede determinar cuándo es estable la línea base, pero también especifica que uno puede determinarlo manualmente…

El software a veces considera la línea base estable incluso con un cierto desplazamiento. Además, iTC200, con una buena S/N, quizás no permita que este desplazamiento afecte mucho el resultado de la medición. Pero debemos entender por qué se vuelve inestable la línea base.

Colocando el sistema lejos del aire acondicionado o de otros factores externos.

Exactamente. Otras causas pueden ser cercanas a otros sistemas que generen campos magnéticos. Un aire acondicionado o un campo magnético podrían causar una fluctuación regular de desplazamiento. Las mismas burbujas dentro de la celda también causan desplazamiento, pues algunas veces pueden estar presentes desde el inicio o generarse ahí mismo. Cuando hay burbujas en la celda de muestra, la solución de la jeringa las desplaza y se produce un patrón de aumento en la línea base. O bien, expulsándose al inicio cambia toda la línea de repente.

Por lo que, en el inicio de la medición, DP debe estar dentro de ±1 µcal/segundo.

Correcto, aunque ±1 µcal/segunda parece un criterio un poco flexible. Lo importante es que esté lo más cercano posible al valor establecido. ¿Es la línea base lo suficientemente estable ahora?

Unos 9.7 µcal/segundo, parece. Hay tiempo de sobra hasta que la medición termine, para tomar un descanso!

Un momento, señor Nakamura. No es recomendable dejarlo solo en este momento.

¿Qué?

Por seguridad, espera hasta completar la segunda titulación.

¿Segunda titulación?

Hasta entonces, verificar la línea de base DP era suficiente, pero ahora hay dos puntos de control más.

¿Dos?

Primero, verifica si la potencia de referencia configurada es adecuada para la interacción objeto. En interacciones biomoleculares suele configurarse a 5 µcal/segundo. Sin embargo, hoy son EDTA y CaCl₂, así que es de 10 µcal/segundo. Verificamos la 1ª titulación con menos volumen de inserción y proceder a la 2ª.

Nota: Al establecer parámetros de titulación, ajusto la primera en un quinto del volumen normal por la dilución inicial relacionando la solución de muestra en la interfaz de la jeringa antes de comenzar la titulación. Por eso, se recomienda en el MicroCal ITC ignorar la primera titulación financiando el análisis.
Y sobre fijar potencia de referencia, recordar los 10 µcal/segundo son para esta reacción y que otros como proteínas generen calor -1µcal/sec lo suficiente debe poder medirlo con 5 µcal/seg. Aunque, incluso una potencia alta no genera problema, podría inducir ruido.

Potencia de referencia mide cuánto calor detectar, aquí podemos medir al menos -10 µcal/seg. Si la señal atraviesa la línea cero de Y, indica configuración inadecuada y no se podrá medir el calor con precisión.

¿Qué ocurre si puedo alterar la potencia intermedia?

No, esa no es posible. Solo parâmetros válidos son los de Parametramento de Inyección.

Aunque reajustes el poder de referencia luego, tendrías valores de concentración incorrectos, entonces reiniciar o continuar siendo valores referenciales.

Entiendo, chequeo el decremento medido tras segunda inserción. Ahora ¿qué sigue?

En cuanto a si el Espaciado es suficiente. El punto esencial es que cada titulación debe regresar su respuesta a la línea base porque el área del pico se considera el calor de reacción.

Los datos están… dentro de rango y la respuesta volvió al nivel base. Esta vez mucho tiempo. Inmediatamente después, se puede cambiar parámetros de inyección, correcto?

¡Correcto, Nakamura! Sin embargo, considera que puede no volver al final del gráfico izquierdo, así que tenlo presente al fijar el Espaciado. ¿Tomamos un descanso?

¡Listo!

A continuación …