El camino hacia la maestría del calorímetro Vol.4
¡Adquiere la habilidad de optimizar experimentos ITC!
Los personajes y la historia que aparecen aquí son ficticios.
En cuanto al contenido técnico, hemos recibido asesoramiento del profesor Fukada, investigador visitante de la Universidad Prefectural de Osaka.
※ Al final de este artículo, puede descargar los materiales.
【Historia anterior】
El Sr. Nakamura de Maruban Pharmaceutical recibió una orden de su jefe, el Sr. Tanaka, para iniciar un calorímetro. Bajo la dirección del profesor Fukada, pudo aprender los conceptos básicos de medición y análisis de iTC200.
【Historia actual】
El Sr. Nakamura, que había adquirido habilidades básicas, decidió realizar primero una medición del anticuerpo-antígeno que tenía a mano. El antígeno es una proteína con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa que compró y preparó el anticuerpo. Se predice que la afinidad es de aproximadamente varios nM a partir de otros resultados de medición.
Parece que la mayoría de los casos en los documentos introducen el anticuerpo en la celda y el antígeno en la jeringa. Al calcular en base al valor C (＊１), si KD es varios nM, la concentración es demasiado baja, así que se aseguraron al menos 10 μM. Aunque 100 μM es necesario si se trata de una unión 1:1, en el caso del anticuerpo bivalente, se necesitan 200 μM de antígeno. ¿Está bien si el anticuerpo es de 5 μM y el antígeno de 100 μM? Como quiero ahorrar muestras, intentaré medir a baja concentración. Primero comenzaremos con el experimento de control (＊２). En cuanto a la cantidad de goteo y el número de goteos, se referencian las condiciones en el manual simple en japonés P.9. El goteo es de 2 μl en 18 veces. Sin embargo, se realiza el primer goteo con 0.4 μl.
※1 El valor C se explica en El camino a la maestría del calorímetro Vol.2.
※2 Sobre el experimento de control, consulte El camino a la maestría del calorímetro Vol.3.
¿Por qué parece que el calor de dilución es tan grande? ¿O es esto normal? Bueno, intentemos medir la muestra de todos modos.
¡No hay casi ningún cambio con el experimento de control! Además, el calor emitido en la segunda mitad de la medición no converge a cero,… Se supone que el tampón es de la misma composición, por lo que es difícil pensar en una desajuste de tampón… ¿Está sucia la jeringa? No, verifiqué el sistema antes de la medición, así que eso no puede ser. Profesor Fukada~.
Sr. Nakamura, ¿qué sucede?
Es que, cuando medí mi muestra, que es un antígeno y un anticuerpo, no se ve casi ninguna diferencia entre los dos datos.
Ah, pues, realmente. Lo que está midiendo es difícil de entender. ¿Ha considerado las causas?
El DP está configurado en 5 μcal/seg en Reference Power y no hay problema; por lo que no puede ser por suciedad en la celda. Consideré que la jeringa de titulación podría estar sucia por el problema de respuesta al titular, pero realicé una verificación del sistema antes de medir y no hubo problemas. Por lo tanto, creo que es un desajuste de tampón, pero estoy usando un tampón de la misma composición. Así que, es difícil de considerar.
Ahora, mencionó que «está utilizando un tampón de la misma composición». ¿No dializó la muestra?
Sí. Esta vez, el anticuerpo es elaborado, pero el antígeno usado es comercial y es de tipo sin portador. Ajusté la concentración del antígeno con un tampón de la misma composición utilizada para purificar el anticuerpo por filtración en gel.
Así que no lo dializó después de la purificación por filtración en gel. ¿El antígeno se preparó en el tampón de filtración en gel?
Estríctamente hablando, utilicé algo preparado por separado para ajustar la concentración del antígeno. Pero debería ser de la misma composición.
Sr. Nakamura, entonces parece que el tampón tenía una composición diferente. Aunque diciendo «de la misma composición», siempre hay algunas diferencias, como durante la medición de reactivos. Incluso si fueron preparados el mismo día, puede haber un cambio si pasa a otro día. Además, el producto sin portador congelado fue usado, ¿verificó las condiciones en que fue formulado? En algunos casos, pueden haber usado TFA o acetonitrilo, los cuales pueden quedar como componentes residuales influyendo en el pH, etc.
¿En serio!? ¿Es así?
En caso de alinear perfectamente la composición del tampón de muestra y titulación, la diálisis es importante. Especialmente para productos comprados, para eliminar elementos de incertidumbre, es mejor dializar junto con el anticuerpo.
Entiendo. Voy a realizar la medición de nuevo después de la diálisis. ¡El ITC es delicado!
Un apunte sobre esto. «Igualar la composición del tampón en celda y jeringa» es muy importante al realizar mediciones ITC. Si se observan grandes reacciones térmicas y variaciones en la reacción térmica en un experimento de control, puede indicar un desajuste entre la solución de ligando y el tampón. Por supuesto, debe tener cuidado de no secar correctamente el metanol empleado en la jeringa. Esto también necesita atención.
Antes de avanzar en un experimento, asegúrese de revisar la configuración del tampón. Si aún así no se puede eliminar la tendencia vista en los resultados del experimento de control, una posible causa puede ser la agregación o autoasociación del ligando. Este tipo de situación requiere revisar las condiciones de medición.
Si no se puede dializar los ligandos de bajo peso molecular, se pueden preparar disolviéndolos directamente después de la diálisis del polímero. Sin embargo, cuidado con muestras que contengan componentes residuales como aditivos o sales. Después de disolver, verifique el pH de la solución usando un pHímetro. Si el pH de la solución de ligando se aparta más de 0.05 del pH del tampón, ajústelo con una pequeña cantidad de solución de HCl o NaOH. Además, cualquier cambio de temperatura debido a pequeñas diferencias en concentración de sal se puede restar usando el experimento de control.
Si está usando ligandos de bajo peso molecular con grupos disociadores de protones, al medir en condiciones donde la concentración del tampón no es suficiente para asegurar un adecuado poder tampón (aunque el ligando sea de unos pocos mM y el componente tampón sea de unos 10 mM), puede influir en el pH, así que por favor tome precauciones.
Al día siguiente…
Dialysis completo. Ajuste de concentración hecho. Sin diferencias en pH. ¡Muestra lista, comenzar medición!
El calor de dilución del experimento de control es constante. La medición de la muestra también converge a la calidez observada hacia la segunda mitad de la medida. ¡La diálisis es clave! Ahora, procedamos con el análisis.
¡El ajuste es bueno! KD es 6nM, con una proporción de enlace de 1.8.
Sr. Nakamura. Has conseguido buenos datos.
Sí. ¡He vuelto a recordar la importancia de la diálisis!
Así es. Por cierto, ¿cómo restaste los datos de control?
Resté los datos crudos siguiendo el manual.
Así es.
Para añadir, el manual sugiere que para sustraer los datos del experimento de control, se utilicen los datos crudos. Si el calor de dilución es constante y hay mucho ruido en el experimento de control, es posible restar el valor promedio. Elija según el caso.
Ahora una pregunta. Esta figura muestra los datos tras restar los datos crudos de control, pero hay un problema con el análisis. ¿Cuál cree que sea?
¿Podría ser que el ajuste es malo?
Sí, es cierto. Pero, ¿por qué el ajuste es malo?
¿Podría ser porque el modelo esté mal?
Pienso que no es por el modelo. ¿Dónde exactamente cree que el ajuste es particularmente malo?
¿Quizás en el lugar donde se forma una meseta en la segunda mitad de la medida?
Sí, efectivamente. ¿Pero por qué cree que pasa eso?
No estoy seguro.
Cuando se realiza el ajuste, el software de análisis calcula para que el calor de la segunda mitad de la medida converja a cero. En estos datos, el gráfico muestra que está por encima de cero al final, ¿verdad? Además, la línea roja del ajuste finaliza en cero.
¡Oh, es cierto! ¡Sí, lo veo!
Entonces Sr. Nakamura, ¿por qué cree que, tras restar el control, el resultado de la medida no es cero?
¿Podría ser que hay una diferencia en el calor de dilución entre el experimento de control y la medición de la muestra, siendo mayor la cantidad de calor emitida en el experimento de control, resultando en un saldo positivo?
Así es. Si obtiene estos datos cuando no puede sustraer adecuadamente el calor de dilución, hay un truco para editar la información de forma que el valor posterior a la curva sigmoide sea cero.
Umm, no se me ocurre cómo.
Cuando no se puede sustrayendo adecuadamente el calor de dilución, dicho truco le permite ajustar los datos como si el valor post-curva fuera cero.
¿Truco? ¿Cómo se hace eso?
Creo que la herramienta Y Translate puede servirle.
¿Y Translate?
Se trata de una herramienta que literalmente permite mover los valores sobre el eje Y. Consulte las instrucciones en los materiales.
Para obtener las instrucciones sobre Y Translate, complete los campos necesarios en el formulario al final del artículo para descargarlo.
Gracias.
Además, necesita familiarizarse con el software de análisis… ¿Existe un manual más detallado del análisis?
Sí, lo hay. Puede descargar el PDF desde la página web de Malvern (en inglés) (se requiere registro de usuario en el sitio web de Malvern).
Se proporciona una guía detallada sobre ejemplos de análisis. Todos los datos están almacenados en la PC entregada.
Además, también se presentan las ecuaciones de ajuste utilizadas en el análisis para su referencia.
Y Translate completado. ¿Mejora el ajuste?
¡Las discrepancias entre el ajuste y el gráfico en la segunda mitad de la titulación se han reducido!
Sr. Nakamura, ha entendido mejor, ¿verdad?
¡Sí!
Por cierto Sr. Nakamura. ¿Qué tampón eligió para esta medición?
Usé un tampón de fosfato durante la preparación del anticuerpo, así que también lo usé para la medición ITC.
Entiendo. Aquí va una pregunta. Aunque tuvieran el mismo pH, si el componente del tampón fuera diferente, ¿cree que se obtendrían los mismos datos?
¡¿Eh?!
Por ejemplo, utilizó un tampón de fosfato esta vez, pero ¿y si usa HEPES o Tris con el mismo pH? ¿Qué ocurriría?
Bueno. Cambiar el tampón a veces altera el resultado del experimento, así que espero alguna diferencia…
Así es. En realidad, hay una pista sobre esto en el manual simple en japonés.
¿De verdad?
Por favor consulte la sección sobre la composición de tampones en la P.5.
Oh, sí, hay una diferencia en la entalpía de protonación en los tampones. Pero ¿cuán grande será en realidad?
Parece que has terminado la medida, ¿quieres discutir esto con una taza de té? (Consulte la columna del profesor Fukada 3 para más detalles).
¡Claro, profesor Fukada! ¡Muchas gracias!
