Cinética de unión de una GPCR

Introducción

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) comprenden una gran clase de proteínas de membrana integrales, cruciales para la transducción de estímulos extracelulares a través de la membrana plasmática para provocar respuestas moleculares y celulares. Regulan una variedad de procesos fisiológicos en eucariotas y representan el mayor grupo de dianas terapéuticas, con más del 30 % de los fármacos disponibles dirigidos a los GPCR.

Las proteínas de membrana son notoriamente difíciles de estudiar debido a la necesidad de un ambiente imitador de membranas y su inestabilidad una vez extraídas de una membrana celular. Aquí mostramos la capacidad de Creoptix WAVE para medir la interacción de un agonista ligando péptido (NTA11) con una variante termoestabilizada del receptor de neurotensina 1 (NTSR1)¹ a la resolución más alta. Esta GPCR media las múltiples funciones de la neurotensina, como la hipotensión, la hiperglucemia, la hipotermia, la antinocicepción y regulación de la motilidad y secreción intestinal².

Materiales y métodos

El receptor se biotiniló in vivo mediante una etiqueta avi y se capturó en un sensor prerecubierto de estreptavidina (WAVEchip DXH-STA). Para el agonista peptídico medido se utilizó una forma mutada y truncada de neurotensina (MW 725 Da), que comprende los residuos 8-13 con una sustitución Y11A. Se registraron curvas dosis-respuesta para 7 concentraciones diferentes de analitos de una serie de diluciones de 3 veces, siendo 300 nm la concentración más alta. El caudal se ajustó a 30 μL/min. El tampón de funcionamiento fue 5 0 nM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, y 0,1 % (p/v) del detergente lauril maltosa-neopentil glicol (L-MNG)³. Todas las mediciones se realizaron a 25 °C.

Resultados

El receptor de neurotensina purificado y biotinilado fue capturado en un sensor pre-recubierto de estreptavidina (WAVEchip DXH-STA) a una densidad de 1350 pg/mm². Se registraron curvas de dosis-respuesta para la unión de agonistas peptídicos (Figura 1), lo que dio lugar a datos de unión que podrían ajustarse bien a un modelo para una interacción 1:1, incluido un término para transporte de masa (MTL). Las tasas cinéticas obtenidas y la constante de equilibrio se resumen en la Tabla 1.

Figura 1: Sensogramas de la interacción entre un péptido de neurotensina modificado (MW 725 Da) como analito y un receptor de neurotensina termoestabilizado (NTSR1, complejo proteína/detergente de 70 kDa) como ligando. Los datos se ajustaron con un modelo para una interacción 1:1 que incluía un término para la limitación del transporte de masa (MTL) utilizando el software WAVEcontrol

Tabla 1: Tasas cinéticas y constante de disociación para el agonista NTA11 obtenidos con un modelo de interacción 1:1 que incluye un término para la limitación del transporte de masa (MTL)

Referencias

1. Egloff, P., Hillenbrand, M., Klenk, C., Batyuk, A., Heine, P., Balada, S., Schlinkmann, K. M., Scott, D. J., Schütz, M., y Plückthun, A. (2014) Estructura del receptor 1 de neurotensina competente en señalización obtenida por evolución dirigida en Escherichia coli. Proc. Nac. Acad. Sci. USA. 111, E655-62.
2. Krumm, B. E., y Grishammer, R. (2015) Reconocimiento de ligando péptido por receptores acoplados a proteínas G. Frontal. Pharmacol. 
3. Chae, P. S., Rasmussen, S. G. F., Rana, R. R., Gotfryd, K., Chandra, R., Goren, M. A, Kruse, A. C., Nurva, S., Loland, C. J., Pierre, Y., Drew, D., Popot, J., Picot, D., Fox, B. G., Guan, L., Gether, U., Byrne, B., Kobilka, B., y Gellman, S. H. (2010) anfífilos de maltosa-neopentil glicol (MNG) para solubilización, estabilización y cristalización de proteínas de membrana. Nat. Métodos 7, 1003–1008.