Meilleures pratiques pour la calorimétrie à titration isotherme pour étudier les interactions de liaison – Partie 3

par Verna Frasca, Tuesday, 19th March 2019

Voici plusieurs meilleures pratiques pour réaliser des expériences de liaison traditionnelles avec les systèmes MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC et iTC200. Ceci est une continuation des blogs précédents ‘Meilleures pratiques pour la calorimétrie à titration isotherme pour étudier les interactions de liaison’ partie 1 et partie 2.

Effectuer régulièrement des vérifications de performance et de validation sur votre ITC

  • Injections d’eau dans l’eau
  • Kit de test ITC avec RNase et EDTA
  • Un autre essai de liaison de référence

Avant les expériences de liaison, effectuez des titrations de contrôle si possible

  • Vérifiez les chaleurs de dilution et d’autres sources de changement thermique
  • La titration de contrôle typique est le ligand dans la seringue ITC, titré dans un tampon correspondant, en utilisant les mêmes paramètres expérimentaux ITC que l’expérience de liaison
  • Les changements thermiques pour la titration de contrôle doivent être petits, reproductibles, et similaires aux changements thermiques à la fin de l’expérience de liaison (Figure 1, en haut)
  • D’autres titrations de contrôle sont tampon-dans-tampon et tampon-dans-macromolécule dans la cellule ITC

Figure 1 : (en haut) Données brutes ITC, avec la titration de contrôle (ligand dans tampon) (rouge), et l’expérience de liaison (ligand dans macromolécule) (noir). Notez que les pics pour la titration de contrôle sont similaires en forme et taille aux injections finales de l’expérience de liaison.

(En bas) Changements thermiques normalisés, avec la titration de contrôle (rouge), et l’expérience de liaison (noir). Les données sont ajustées selon le modèle de liaison d’un ensemble de sites.

Évaluation des données brutes ITC : à quoi ressemblent les données brutes d’une expérience ITC idéale pour un événement de liaison (1:1)

Voir figures 1 et 2.

  • Le graphique des données de titration commence par une série de pics importants et approximativement égaux (exothermiques ou endothermiques), représentant près de 100% de liaison du ligand à la macromolécule
  • Les changements thermiques diminuent à mesure que les sites de liaison sont saturés par de nouvelles injections de ligand pendant l’expérience
  • Les pics finaux, correspondant aux chaleurs de dilution du ligand après que la liaison est pleinement saturée, doivent être petits et reproductibles (Figures 1 et 2)
  • Ce type de courbe de titration donnera une isotherme de liaison sigmoïdale (Figure 1 en bas)
  • Besoin de changements thermiques suffisants au-dessus du bruit de fond pour obtenir des données ITC de haute qualité
  • Chaleurs d’injection (aire intégrée) :
    • Pour PEAQ-ITC et ITC200 : >2.5 µcal pour le second (premier complet) pic est idéal
      • ~1 µcal pour le second pic est la chaleur minimale pour l’analyse des données
    • Pour VP-ITC : >10 µcal pour le second (premier complet) pic est idéal
      • ~3-5 µcal pour le second pic est la chaleur minimale pour l’analyse des données
    • En dessous de cette plage de détection thermique, les données peuvent être plus bruyantes en raison d’un rapport signal/bruit plus faible
  • La position de la ligne de base (en µcal/sec) pour les données ITC brutes doit être à 1 µcal/sec du réglage de puissance de référence. Si la différence est supérieure à 1 µcal/sec, cela peut indiquer une cellule ITC sale, et/ou des bulles dans la cellule de référence ou d’échantillon
  • Toutes les valeurs DP (axe Y) pour les données ITC brutes doivent être supérieures à 0 µcal/sec
  • La position de la ligne de base post-injection doit être la même que la ligne de base pré-injection. Sinon, il se peut qu’il n’y ait pas suffisamment de temps entre les injections, ou qu’il y ait un autre processus causant un changement de DP, comme l’hydrolyse enzymatique
  • Une légère dérive de la ligne de base tout au long de la titration est normale. S’il y a une bonne intégration de la ligne de base, les données sont correctes (Figure 2). Vous ne voulez pas de grands sauts dans la ligne de base ou de « pas

Figure 2. Données ITC de haute qualité. Notez la légère dérive dans l’intégration de la ligne de base (en rouge) – cela est acceptable.

Plus d’informations sur la valeur N à partir de l’ajustement de la courbe ITC

N est associé à la concentration totale de la macromolécule et est l’un des paramètres déterminés pendant l’analyse des données. Il est important de comprendre que la valeur N de l’ITC n’est PAS toujours la même chose que la stœchiométrie (rapport de liaison) de la liaison du ligand à la macromolécule. La valeur N est en fait égale à la stœchiométrie si les concentrations utilisées pour l’ajustement sont correctes et actives à 100 %.

Une autre manière d’exprimer la valeur N est cette équation :

N = St x [AFcell/AFsyr]

Où St est la stœchiométrie (nombre de sites de liaison que la macromolécule a pour le ligand), AF est la « fraction active » de la biomolécule (la concentration active divisée par la concentration totale), AFcell est la fraction active de l’échantillon dans la cellule (typiquement la macromolécule), et AFsyr est la fraction active de l’échantillon dans la seringue (typiquement le ligand).

Chacune des trois valeurs dans cette équation peut changer N, ce qui signifie que N est une mesure du rapport de liaison autant que de l’activité de l’échantillon ou des échantillons. Deux de ces valeurs doivent être connues (ou supposées) pour obtenir la troisième. Par exemple, si l’on est intéressé par la stœchiométrie, alors les concentrations fournies dans l’ajustement doivent être précises et actives à 100 %. Si l’on est intéressé par l’activité de l’échantillon dans la cellule (souvent la macromolécule), alors la stœchiométrie et la concentration active de l’échantillon dans la seringue (ligand) doivent être supposées.

Dans le logiciel d’analyse des données PEAQ-ITC, vous pouvez également ajuster les données en fixant N à 1 (ou à la valeur souhaitée) et en faisant varier la concentration dans la cellule ou la seringue.

Si N est inférieur à la stœchiométrie attendue, votre concentration de macromolécule active dans la cellule est inférieure à la concentration totale, et/ou votre concentration de ligand active est supérieure à la concentration totale.

Si N est de 0,5, il est possible que votre macromolécule (dans la cellule ITC) soit un dimère et lie un ligand par dimère. Il est également possible que votre biomolécule dans la seringue ait 2 sites de liaison, et que l’échantillon dans la cellule ait un site de liaison, vous devriez donc essayer d’ajuster la courbe de liaison en utilisant l’option « ligand dans cellule ».

Si N est supérieur à la stœchiométrie attendue, votre concentration de macromolécule active dans la cellule est supérieure à la concentration totale, et/ou votre concentration de ligand active est inférieure à la concentration totale.

Des erreurs dans la concentration de ligand dans la seringue entraînent des erreurs dans les mesures de N, KD et ΔH, et donc dans l’énergie libre calculée (ΔG) et la contribution entropique (-TΔS) à la liaison. Des erreurs dans la concentration de macromolécule dans la cellule affectent principalement la précision de la valeur N déterminée.

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