Les meilleures pratiques pour la calorimétrie de titrage isotherme pour étudier les interactions de liaison – Partie 4

par Verna Frasca, Thursday, 18th April 2019

Voici plusieurs meilleures pratiques pour réaliser des expériences de liaison traditionnelles avec les systèmes MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC et iTC200. Ceci est une continuation des blogs précédents ‘Les meilleures pratiques pour la calorimétrie de titrage isotherme pour étudier les interactions de liaison’ partie 1, partie 2 et partie 3.

Problèmes courants avec les données brutes ITC, et causes possibles

  • Chaleur d’injection importante, due à de grandes chaleurs de dilution :

    • Cela est généralement dû à un déséquilibre des solutions de macromolécule et de ligand, qui est beaucoup plus important que la chaleur de liaison réelle.
    • L’isotherme de liaison ressemble souvent à une ligne droite, sans preuve de saturation de liaison.
    • Typiquement, ce grand changement de chaleur ne peut pas être corrigé par la soustraction d’un titrage de contrôle.

  • DP ne revient pas à la ligne de base avant injection avant la prochaine injection.

    • Cela peut être dû à un temps insuffisant entre les injections pour permettre une mesure complète de la chaleur de liaison.
    • Le changement de chaleur n’est pas mesuré pour chaque injection, affectant la qualité des données. Ajuster le volume d’injection, réduire la concentration de ligand, et/ou allonger le temps entre les injections.
    • Si vous remarquez cet effet pendant l’expérience, vous pouvez augmenter l’intervalle entre les injections pour les injections restantes.
    • Il peut également y avoir un autre processus (plus lent) provoquant un changement de chaleur, tel que des changements conformationnels.

  • Pics dans les injections, certains pics sont beaucoup plus grands (ou beaucoup plus petits) que d’autres :

    • Causé par des bulles dans la cellule ITC et/ou la seringue, ou une pointe de piston sale ou endommagée dans l’injecteur ITC.

  • Ligne de base bruyante et/ou pics entre les injections :

    • Bulles d’air dues à un mauvais remplissage de la cellule et/ou de la seringue, cellules et/ou seringue sales.
    • Peut également être dû à une aiguille d’injection tordue ou à un problème avec le système d’injection.

  • Changement de la ligne de base : il y a un changement dans la capacité thermique du système, dû à l’hydrolyse enzymatique, au pH ou à un déséquilibre de tampon :

    • Si vous étudiez la liaison entre le substrat et l’enzyme, utilisez un substrat non hydrolysable.
    • Le changement de la ligne de base peut également être dû à des bulles dans la cellule ITC ou la seringue, en raison d’un sous-remplissage.

  • Aucune chaleur de liaison détectable :

    • Il n’y a pas de liaison.
    • Il est possible que la liaison ait lieu, mais le changement de chaleur est trop faible. L’enthalpie de liaison peut être inférieure à ce qui est attendu, et/ou l’affinité de liaison plus faible que prévu.
    • Pour augmenter le changement de chaleur/injection, vous devez augmenter la concentration de macromolécule et/ou de ligand ; augmenter le volume d’injection, et/ou modifier la condition expérimentale, comme la température expérimentale ou le tampon/pH.

Correction de la chaleur de dilution, avant l’analyse des données

  • Comme discuté dans les blogs précédents, il est essentiel d’avoir une correspondance étroite des solutions de macromolécule et de ligand pour éviter les grandes chaleurs de dilution qui pourraient masquer le signal de liaison réel. Ces chaleurs non liées doivent être soustraites de chacun des points de l’isotherme de liaison titration macromolécule-ligand avant toute analyse de données supplémentaire. Cela peut être réalisé de plusieurs façons :
  • Une estimation de la chaleur de dilution peut être obtenue directement à partir du titrage expérimental en faisant la moyenne des chaleurs intégrées associées aux quelques dernières injections. Cette soustraction peut être faite en utilisant l’option « Simple Math » dans l’analyse des données d’Origin. Cette méthode suppose que les sites de liaison ont été entièrement saturés avec le ligand à la fin de l’expérience ITC.
  • Pour PEAQ-ITC, on peut également utiliser l’option « compensation ajustée » lors de l’analyse des données pour corriger la chaleur de dilution.
    • Si vous avez un titrage de contrôle de la solution de ligand dans le tampon, vous pouvez effectuer une soustraction point par point des valeurs de pic intégrées de ce contrôle par rapport à celles de l’expérience. Pour les petites chaleurs de liaison, cette correction pourrait entraîner un isotherme de liaison plus bruyant, comparé à la soustraction d’une constante.
  • Notez que le titrage de contrôle devrait donner des chaleurs d’injection reproductibles tout au long du titrage et aboutir à un tracé linéaire sans pente ou avec une pente faible (Figure 1).
  • Au lieu d’une correction point par point, vous pouvez créer une ligne, ou obtenir un changement moyen de chaleur d’injection pour le titrage de contrôle et le soustraire des données expérimentales.
  • Si les quelques dernières injections de la courbe de liaison expérimentale ont une pente différente de zéro, et/ou si le titrage de contrôle n’est pas linéaire ou a une grande pente, vous devriez considérer les raisons possibles de ces résultats et voir si cela peut être correctement corrigé.
  • Une fois les chaleurs de dilution prises en compte par l’une de ces approches, l’enthalpie de liaison à saturation devrait tendre vers zéro et l’isotherme de liaison peut être ajusté en utilisant un modèle approprié pour déterminer les paramètres de liaison.

Figure 1 : Données brutes ITC, avec le titrage de contrôle (ligand dans tampon) (rouge), et l’expérience de liaison (ligand dans macromolécule) (noir). Notez que les pics pour le titrage de contrôle sont similaires en forme et en taille aux dernières injections de l’expérience de liaison.

Figure 1 : Variations de chaleur normalisées, avec le titrage de contrôle (rouge), et l’expérience de liaison (noir). Les données sont ajustées au modèle de liaison à un ensemble de sites.

Optimisation des expériences ITC, après les premières expériences

  • Il est possible de changer et modifier la forme de l’isotherme de liaison en ajustant la concentration de l’échantillon dans la cellule et/ou l’échantillon dans la seringue pour optimiser la qualité des données obtenues. Vous pouvez également changer le volume d’injection et le nombre d’injections. Si vous avez des données préliminaires, vous pouvez utiliser le « Design Experiment » assistant d’options avancées, ou un autre outil de simulation de données ITC, pour simuler des isothermes de liaison et concevoir de futures expériences.
  • Vous pourriez ne pas être en mesure d’utiliser la(les) concentration(s) « optimale(s) » pour votre liaison : des concentrations de réactif très faibles pourraient conduire à un signal expérimental trop faible (qui dépend du ΔH de liaison), tandis que des concentrations très élevées pourraient simplement être peu pratiques ou impossibles à atteindre pour les biopolymères (par exemple si une protéine a tendance à s’agréger à haute concentration).
  • Si vous n’êtes pas en mesure d’obtenir une concentration de ligand suffisamment élevée pour atteindre la saturation de liaison après l’injection du contenu du volume de la seringue, vous pouvez garder le complexe macromolécule-ligand dans la cellule ITC, remplir la seringue avec plus de ligand, et effectuer une deuxième expérience de titrage. Cela peut être répété jusqu’à ce que la saturation de liaison soit atteinte.
  • Que se passe-t-il si l’affinité de liaison et la concentration de macromolécule aboutissent à une valeur C en dehors de la plage optimale ? Pour les réactions de liaison très fortes (où des conditions de C> 1000 sont probables), seuls ΔH et N peuvent être déterminés avec précision directement à partir d’une expérience ITC. Cependant, d’autres approches, telles que l’utilisation d’une expérience de déplacement/compétition avec un ligand attaché faible, peuvent encore permettre à l’utilisateur de déterminer un KD.
  • Pour les événements de liaison faibles, il peut encore être possible d’obtenir des données utiles en travaillant dans la « plage de basse C » (valeurs de C inférieures à 1-5) en utilisant une très haute concentration de ligand pour pousser la liaison vers la saturation à la fin du titrage. Dans ce scénario, les isothermes de liaison ont tendance à être non sigmoïdes, et peuvent nécessiter la fixation de N lors de l’ajustement, de sorte que seule l’affinité de liaison peut être mesurée avec confiance. ΔH ne sera pas bien défini par l’expérience. Cependant, dans les cas où N est connu avec assurance, et peut être fixé dans la procédure d’ajustement si nécessaire, de telles expériences peuvent encore être très instructives. Vous pouvez également faire une expérience de déplacement/compétition conçue pour caractériser les liaisons faibles.

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