Comparaison entre la fluorescence intrinsèque et la fluorescence extrinsèque

Quelle est la différence entre la fluorescence intrinsèque et la fluorescence extrinsèque ?

La spectroscopie de fluorescence est l’une des techniques les plus utilisées dans la caractérisation des protéines, appréciée pour sa sensibilité, sa rapidité et le faible volume d’échantillon requis. Les techniques de spectroscopie de fluorescence, comme la fluorimétrie différentielle à balayage (DSF), révèlent comment une protéine est repliée, à quel point elle est stable et comment elle se comporte lorsqu’elle interagit avec d’autres molécules.  

Il existe deux approches différentes de la spectroscopie de fluorescence : la fluorescence intrinsèque, qui lit la lumière déjà émise par une protéine, et la fluorescence extrinsèque, qui utilise un colorant ajouté pour renseigner sur ce qui se passe à la surface de la protéine. 

La fluorescence intrinsèque et la fluorescence extrinsèque sont des outils établis dans les flux de travail de caractérisation des protéines et de développement des biomédicaments, et toutes deux sont utilisées pour le criblage de la développabilité, la stabilité des formulations et les études de comparabilité. Cependant, elles ne mesurent pas la même chose – et connaître la différence entre fluorescence intrinsèque et extrinsèque change la méthode à choisir pour un problème donné. 

C’est ce vide que le Zetasizer Core, la nouvelle plateforme biophysique de stabilité à haut débit de Malvern Panalytical, a été conçu pour combler. Il réalise les deux approches à partir d’un seul échantillon, aux côtés de la diffusion statique de la lumière (SLS) et de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). 

Qu’est-ce que la fluorescence intrinsèque ?

La fluorescence intrinsèque des protéines provient de trois acides aminés aromatiques : la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane. Le tryptophane domine le signal, car il présente l’absorbance la plus forte et la plus grande longueur d’onde d’émission des trois. Par conséquent, la plupart des travaux de spectroscopie de fluorescence intrinsèque suivent spécifiquement le tryptophane, même dans les protéines qui contiennent également de la tyrosine et de la phénylalanine. 

Le tryptophane absorbe la lumière UV autour de 280 nm et émet entre environ 300 et 400 nm.  La longueur d’onde exacte dans cette plage à laquelle il émet dépend de son environnement local :

• Le tryptophane enfoui, situé dans le cœur hydrophobe d’une protéine repliée, émet plus près de 330 nm. 
• Le tryptophane exposé, devenu orienté vers la surface, que ce soit parce que la protéine s’est déroulée ou parce qu’un événement de liaison a modifié son environnement, émet plus près de 350 nm. 

Ce décalage est la base de la technique de fluorescence intrinsèque : lorsqu’un résidu de tryptophane est exposé en raison du dépliement de la protéine ou passe d’un environnement non polaire à un environnement polaire, la longueur d’onde et l’intensité de son émission changent. Le suivi de ce décalage révèle une modification structurelle, sans qu’il soit nécessaire d’ajouter quoi que ce soit à l’échantillon. 

Que mesure la fluorescence intrinsèque ?

La fluorescence intrinsèque mesure :

• Le repliement et le dépliement des protéines : la fluorescence intrinsèque est sensible à la transition structurelle à grande échelle qu’une protéine subit sous l’effet d’un stress thermique ou chimique, ce qui en fait une solution naturelle pour les études de stabilité. 
• Les changements conformationnels : des réarrangements structurels plus modestes, sans aller jusqu’au dépliement complet, modifient néanmoins l’environnement local d’un ou de plusieurs résidus de tryptophane, et se répercutent donc dans le spectre. 
• La liaison de ligands : lorsqu’un ligand se lie près d’un résidu de tryptophane, il modifie l’environnement immédiat de ce résidu et entraîne une variation de l’émission, offrant à la fluorescence intrinsèque un moyen sans marquage de détecter et de caractériser les événements de liaison. 

Avantages et inconvénients de la fluorescence intrinsèque 

Les avantages de la fluorescence intrinsèque comprennent :

• Sans marquage : aucun ajout n’est fait à l’échantillon, il n’y a donc aucun risque qu’un colorant perturbe l’état natif de la protéine.
• Structure native : comme rien n’est ajouté, les résultats reflètent la protéine dans sa forme naturelle, biologiquement pertinente. 

La limitation de la fluorescence intrinsèque dépend du fait que la protéine possède, au départ, des fluorophores exploitables. Les protéines contenant très peu de résidus de tryptophane donnent un signal faible, et celles qui en possèdent plusieurs dans des environnements différents produisent un signal composite qui peut rendre plus difficile l’isolement et l’interprétation des transitions structurelles individuelles. 

Comment le Zetasizer Core aide-t-il à mesurer la fluorescence intrinsèque ?

La fluorescence intrinsèque est le principe à la base de l’analyse DSF du Zetasizer Core. Plutôt qu’un instantané unique, elle suit le rapport de deux longueurs d’onde d’émission – généralement F350/F330 – au cours d’une rampe de température contrôlée. 

À mesure que la protéine chauffe et se déplie, ce rapport trace une courbe sigmoïde, à partir de laquelle le début du dépliement (T_on) et la température de fusion (T_m), le point auquel la moitié de la population protéique s’est dépliée, peuvent être calculés. Un T_m plus élevé signifie une plus grande résistance à la dénaturation induite par la chaleur, si bien que la DSF est couramment utilisée pour classer des molécules candidates, cribler des conditions de tampon et de formulation, et suivre la stabilité tout au long d’un pipeline de développement. 

La DSF est une technique qui récompense la précision et la reproductibilité, puisque le résultat dépend entièrement de la résolution exacte d’un décalage de longueur d’onde, et pas seulement d’un changement d’intensité. De plus, puisqu’aucun colorant n’est requis, elle fournit des données sur l’état natif de la protéine.  

Qu’est-ce que la fluorescence extrinsèque ?

La fluorescence extrinsèque utilise une technique différente : au lieu de lire le propre signal intrinsèque de la protéine, elle consiste à ajouter un colorant fluorescent conçu pour interagir avec des caractéristiques spécifiques de la protéine lorsqu’elles deviennent accessibles. La plupart des colorants utilisés dans les études de stabilité sont faiblement fluorescents dans un tampon aqueux et s’illuminent lorsqu’ils se lient à des régions hydrophobes (normalement enfouies à l’intérieur d’une protéine repliée) ou interagissent avec des états protéiques dépliés au moment où ils apparaissent. 

Que mesure la fluorescence extrinsèque ?

La fluorescence extrinsèque mesure :

• La détection de l’agrégation : les colorants extrinsèques peuvent distinguer une agrégation précoce, où seule une surface hydrophobe limitée est exposée, d’une agrégation plus avancée et à plus grande échelle. 
• L’exposition hydrophobe : une augmentation du signal du colorant est une lecture directe de la surface hydrophobe nouvellement exposée, ce qui signale souvent un intermédiaire de dépliement plutôt que l’état final totalement dénaturé.
• La stabilité : le suivi de la fluorescence du colorant au cours d’une rampe thermique produit une courbe de stabilité ayant globalement la même forme qu’une courbe DSF intrinsèque, mais construite à partir d’un signal différent. 

Comme la fluorescence extrinsèque répond à l’exposition de surface plutôt qu’au repositionnement d’un seul résidu, elle complète naturellement les mesures intrinsèques au lieu de les dupliquer.  

Avantages et limites de la fluorescence extrinsèque 

Les avantages de la fluorescence extrinsèque comprennent :

• Haute sensibilité : utile pour détecter l’instabilité très tôt, avant qu’elle n’apparaisse ailleurs.
• Sonde ciblée : des colorants peuvent être sélectionnés pour des applications spécifiques, ce qui est précieux pour le criblage de formulations.  

Les limites de la fluorescence extrinsèque comprennent :

• Sélection et optimisation du colorant : cela prend du temps et ajoute de la variabilité entre les dosages. 
• Risque d’interaction : un colorant qui interagit avec l’état natif de la protéine peut décaler artificiellement le T_m mesuré ; des additifs hydrophobes du tampon peuvent se lier directement au colorant et augmenter le bruit de fond ; et les protéines présentant déjà des zones hydrophobes en surface peuvent commencer avec une fluorescence de base élevée qui masque le véritable signal de dénaturation. 

Comment la DLS à haut débit aide-t-elle avec la fluorescence de balayage ?

La diffusion dynamique de la lumière (DLS) à haut débit ajoute une troisième lecture indépendante au-dessus d’un dosage de fluorescence. La DLS peut détecter directement les changements de taille des particules liés à l’agrégation, confirmant ce qu’un dosage de fluorescence ne peut qu’inférer.  

Différences clés entre fluorescence intrinsèque et fluorescence extrinsèque 

Propriété	Fluorescence intrinsèque	Fluorescence extrinsèque
Source du signal	Lit le signal de tryptophane propre à la protéine	Lit un colorant ajouté spécifiquement pour l’essai
Préparation	Aucune préparation d’échantillon ni colorant nécessaire, ce qui simplifie le flux de travail	Nécessite un colorant compatible sélectionné et titré pour chaque combinaison protéine/tampon
Sensibilité	Fiable pour détecter la transition structurelle globale lors d’événements majeurs de dépliement, mais moins sensible aux changements subtils et précoces	Particulièrement réactive à une exposition hydrophobe précoce et subtile – idéale pour détecter l’instabilité le plus tôt possible
Spécificité	Moyenne la contribution de chaque résidu de tryptophane dans la protéine, offrant une lecture globale de la structure	Un colorant ciblé peut être choisi pour renseigner sur une caractéristique structurelle particulière, pour une lecture plus détaillée et localisée

Comment la combinaison de la DSF et de la DLS à haut débit améliore les flux de travail de fluorescence intrinsèque et extrinsèque 

La fluorescence intrinsèque est la lecture la plus sensible de la transition structurelle elle-même, tandis que la fluorescence extrinsèque est la lecture la plus sensible de ce que cette transition expose – et vers quoi elle mène. Utilisées ensemble, une protéine qui montre un décalage de fluorescence intrinsèque mais aucune réponse du colorant extrinsèque peut subir un changement conformationnel qui n’aboutit pas à une agrégation – alors qu’une protéine qui montre les deux évolue plus probablement vers celle-ci. 

Associer la fluorescence intrinsèque et extrinsèque à la DLS à haut débit réduit encore l’incertitude dans l’interprétation des données, car chaque technique fournit une confirmation orthogonale du même événement. Une transition de dépliement observée en DSF et accompagnée d’une augmentation de la taille des particules en DLS constitue un signal de stabilité bien plus fiable que l’une ou l’autre technique prise isolément.  

C’est pourquoi les flux de travail intégrés deviennent la norme dans le développement de formulations : ils sont plus efficaces (une seule analyse au lieu de plusieurs) et plus fiables pour les décisions de type go/no-go qui structurent un programme de biomédicaments. 

Trois avantages de la combinaison des flux de travail DLS et DSF 

1. Validation croisée des résultats : un événement signalé par une technique peut être vérifié par l’autre, au lieu d’être pris pour acquis. 
2. Réduction des faux positifs : un vrai signal d’instabilité apparaît de manière cohérente d’une technique à l’autre, ce qui élimine les artefacts qu’une méthode unique pourrait autrement signaler. 
3. Une compréhension plus complète du comportement des protéines : les transitions structurelles, l’exposition de surface et la taille des particules se combinent en un seul ensemble, plutôt que trois signaux distincts à réconcilier manuellement. 

C’est la combinaison sur laquelle repose le Zetasizer Core : réunir la DSF et la DLS à haut débit sur une seule plateforme afin de fournir des données complètes sur la stabilité à partir d’un seul échantillon. 

Analyse combinée DSF et DLS : trois exemples d’application 

• Dépliement thermique : la fluorescence intrinsèque identifie le point de transition (T_on, T_m) au fur et à mesure que la protéine est chauffée. 
• Détection de l’agrégation : la fluorescence extrinsèque signale l’exposition hydrophobe précoce au moment où elle se produit. 
• Confirmation de la taille des particules : la DLS confirme si cette exposition se traduit par une augmentation réelle de la taille des particules. 
• La combinaison de ces trois éléments donne à un scientifique des formulations une base beaucoup plus solide pour une décision go/no-go que n’importe quel signal pris isolément. 

Combinez la DSF avec la DLS à haut débit pour une analyse plus efficace de la fluorescence intrinsèque et extrinsèque 

Ni la fluorescence intrinsèque ni la fluorescence extrinsèque n’est individuellement supérieure ; chacune répond à une question différente. Le bon choix dépend de ce que vous devez savoir : la transition structurelle elle-même, ce qu’elle expose, ou les deux. La fluorescence intrinsèque des protéines reste la vue sans marquage, à l’état natif, de la stabilité propre d’une protéine, tandis que la fluorescence extrinsèque reste l’angle plus ciblé sur l’agrégation et l’exposition hydrophobe. De plus en plus, les deux sont utilisées côte à côte, appuyées par des données de taille des particules, plutôt que les scientifiques aient à choisir entre elles. 

Cette approche analytique combinée est exactement ce que le Zetasizer Core fournit, en permettant une analyse robuste de la fluorescence intrinsèque, sans colorant, associée à une DLS à haut débit pour la validation de l’agrégation, le tout sur une seule plateforme.