Comment fonctionne le GPC/SEC à détecteurs multiples ?

par Kyle Williams, Thursday, 20th June 2019

Que vos échantillons soient des polymères synthétiques, des matériaux naturels tels que les polysaccharides, ou des protéines, des anticorps ou d’autres échantillons biologiques, la chromatographie par perméation de gel / chromatographie d’exclusion de taille (GPC/SEC) est la technique idéale pour caractériser ces types de macromolécules et d’autres encore. Les informations fournies par l’analyse GPC/SEC incluent la masse moléculaire (MW), la taille moléculaire sous forme de rayon hydrodynamique (Rh) et rayon de giration (Rg), la viscosité intrinsèque (IV), la concentration, l’analyse de composition et les données de ramification, parmi d’autres paramètres. Les données disponibles dépendent de la combinaison de détecteurs présents, car divers détecteurs se combinent pour offrir différentes parties du puzzle de la caractérisation. Cet article expliquera comment les différents détecteurs, disponibles sur les plateformes OMNISEC et Viscotek TDA, travaillent ensemble pour fournir une caractérisation complète d’un échantillon. Pour plus de détails (et d’équations !), veuillez consulter notre livre blanc sur les principes du GPC/SEC à détecteurs multiples.

Les relations entre les détecteurs et les paramètres moléculaires sont résumées graphiquement dans la figure ci-dessus. Le graphique commence en bas avec l’attribut de l’échantillon mesuré directement par chaque détecteur, puis il monte vers les valeurs directement calculées à partir des réponses des détecteurs observés et se termine en haut avec les informations calculées à partir des données directement calculées.

Les quatre détecteurs le plus souvent associés à un système GPC/SEC à détecteurs multiples entièrement équipé sont un détecteur d’indice de réfraction différentielle (RI), un détecteur de diffusion de la lumière (RALS/LALS ou MALS), un détecteur viscométrique différentiel, et un détecteur UV. La caractéristique spécifique d’un échantillon à laquelle ces détecteurs répondent est indiquée sur la ligne du bas de la figure ci-dessus. Le détecteur RI réagit au changement d’indice de réfraction entre la solution de l’échantillon et le solvant de référence. Le détecteur de diffusion de la lumière réagit plus fortement à la masse moléculaire de l’échantillon, les échantillons de masse moléculaire élevée produisant une réponse plus intense. Le signal du détecteur viscométrique différentiel est basé sur la différence de viscosité de la solution d’échantillon par rapport au solvant de référence. La réponse du détecteur UV est basée sur le niveau d’absorbance de l’échantillon. Un échantillon sans chromophore qui n’absorbe pas la lumière UV ne produit aucun signal UV.

Tous les systèmes GPC/SEC doivent avoir au moins un détecteur de concentration, quels que soient les autres détecteurs présents. Les détecteurs RI et UV sont considérés comme des détecteurs de concentration car leurs réponses sont directement proportionnelles à la concentration de l’échantillon. La plupart des systèmes utilisent un détecteur RI car tous les échantillons ne sont pas actifs aux UV. Avec la connaissance de la valeur dn/dc d’un échantillon, ou de l’incrément d’indice de réfraction, la concentration exacte d’un échantillon à chaque découpage de données peut être calculée à partir du détecteur RI. De même, en utilisant un détecteur UV, la connaissance de la valeur dA/dc de l’échantillon, qui est liée à son coefficient d’extinction molaire, permettra de calculer la concentration de l’échantillon à chaque découpage de données. Avec les détecteurs RI et UV, la composition d’un échantillon composé de deux composants peut être déterminée.

Connaître la concentration exacte de l’échantillon à chaque découpage de données enregistré est essentiel, car cela est nécessaire pour déterminer la masse moléculaire et la viscosité intrinsèque, deux des paramètres moléculaires clés inclus dans la section calculée directement de la figure hiérarchique précédente. Un examen des équations régissant les réponses des détecteurs énumérés ci-dessus révèle pourquoi la concentration de l’échantillon est essentielle. Si nous nous concentrons sur l’équation de diffusion de la lumière, la sortie du détecteur est observée, le KLS représente la constante du détecteur obtenue en analysant un standard étroit, la masse moléculaire est inconnue, la valeur dn/dc est connue car elle est utilisée dans l’équation pour le détecteur RI pour calculer la concentration, qui est ensuite intégrée dans l’équation de diffusion de la lumière, et le volume d’injection est connu car il est réglé par l’utilisateur. Cela laisse la masse moléculaire comme unique inconnue. Grâce à la combinaison des détecteurs RI et de diffusion de la lumière, la masse moléculaire d’un échantillon peut être calculée à chaque découpage de données. Les masses moléculaires calculées sont ensuite intégrées sur le pic d’échantillon défini et les moments de masse moléculaire sont calculés en fonction des concentrations relatives de chaque fraction.

Un processus analogue se déroule avec les détecteurs RI et viscométrique pour calculer directement l’IV de l’échantillon à chaque découpage de données et produire une valeur IV pondérée moyenne.

Passant des données calculées directement au milieu, le niveau supérieur de la figure hiérarchique montre que la masse moléculaire et l’IV d’un échantillon peuvent être combinés pour calculer indirectement des paramètres offrant un aperçu de la structure moléculaire de l’échantillon.

La taille d’un échantillon est généralement la seconde après la masse moléculaire en termes de données de caractérisation fréquemment recherchées, et le Rh est le paramètre de taille le mieux adapté à tous les types d’échantillons. Il convient de noter que Rg peut être calculé à partir d’un détecteur de diffusion de la lumière avec au moins deux angles et un détecteur de concentration (d’où son placement dans le niveau intermédiaire), cependant l’échantillon doit être suffisamment grand pour montrer une dépendance angulaire. De nombreux échantillons, y compris les protéines, ne sont pas assez grands pour le faire et donc le Rg ne peut pas être calculé pour ces échantillons. En revanche, le Rh peut être calculé tant qu’il y a des données d’un détecteur de concentration, d’un détecteur de diffusion de la lumière et d’un détecteur viscométrique suffisantes pour produire des données de masse moléculaire et d’IV. Le Rh représente le rayon de la sphère théorique occupée par un échantillon avec la masse moléculaire calculée et l’IV. Puisque l’IV est décrit en termes de dL/g, ou volume divisé par masse, il peut être combiné avec le terme de masse de la masse moléculaire pour calculer un volume théorique pour l’échantillon. Un modèle sphérique basé sur (4/3)πr3 est appliqué pour déterminer r, qui est finalement le Rh de l’échantillon.

Les paramètres de Mark-Houwink (MH) sont calculés à partir du graphique MH, qui trace l’IV de l’échantillon contre sa masse moléculaire pour fournir une représentation visuelle de la relation entre les deux. Ces graphiques MH utilisent les données acquises par trois détecteurs (concentration, diffusion de la lumière et viscomètre) et peuvent illustrer les changements de structure moléculaire au sein d’un même échantillon ou mettre en évidence les différences entre plusieurs échantillons. Un usage fréquent de ces graphiques consiste à identifier et quantifier l’étendue de la ramification dans la distribution d’un échantillon.

L’analyse GPC/SEC à détecteurs multiples offre une gamme de données de caractérisation concernant divers aspects d’un échantillon en utilisant une série de détecteurs qui mesurent différents paramètres moléculaires. Avec un ensemble complet de détecteurs fonctionnant de concert, le résultat est une collection de données qui dépasse de loin ce qui serait accessible à un système à détecteur unique. Grâce aux mesures directes des détecteurs individuels, certains paramètres peuvent être calculés directement. Et à partir de là, le logiciel peut obtenir d’autres données calculées indirectement, culminant dans des informations offrant un aperçu structurel de l’échantillon. Tout cela d’une seule injection de votre échantillon!

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