Rh ou Rg : Quel est le meilleur pour mes échantillons de GPC/SEC?
L’objectif principal de l’utilisation de la chromatographie sur gel de perméation / chromatographie d’exclusion stérique (GPC/SEC) est souvent de déterminer la masse moléculaire d’un échantillon macromoléculaire. Les systèmes multi-détecteurs, tels que les systèmes OMNISEC et TDAmax de Malvern Panalytical, sont capables d’offrir une gamme d’autres paramètres de caractérisation moléculaire, y compris la taille moléculaire. Dans certaines situations, telles que l’analyse de protéines ou d’autres échantillons dont la masse moléculaire est déjà connue, le but unique de l’analyse est de déterminer la taille moléculaire de l’échantillon. Dans ces cas, la taille moléculaire peut révéler des informations cruciales sur la structure moléculaire de l’échantillon, souvent étroitement liée à la fonction ou à l’application finale de l’échantillon.
Il existe deux mesures courantes de la taille moléculaire disponibles grâce à l’analyse GPC/SEC : le rayon hydrodynamique (Rh) et le rayon de giration (Rg). Un billet précédent décrit comment Rh et Rg sont utilisés dans la caractérisation des protéines en utilisant la diffusion de lumière dynamique (DLS) et la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). Ce billet discutera des définitions de Rh et Rg, comment les deux sont calculés dans un contexte GPC/SEC, et les ramifications pratiques de ces différences. Pour plus de détails (et plus d’équations !) sur les sujets abordés ici, veuillez consulter ces documents liés.
Définitions de Rh et Rg
Sans plonger trop profondément dans les mathématiques (pour le moment), le Rh d’un échantillon est le rayon d’une sphère théorique possédant la même masse et densité calculée pour l’échantillon à partir de sa masse moléculaire et viscosité intrinsèque. Le Rg représente la distance quadratique moyenne des composants de la molécule par rapport au centre de masse de la molécule. Les valeurs uniques de Rh et Rg générées par une analyse GPC/SEC sont les valeurs moyennes en poids obtenues en compilant les valeurs calculées à chaque tranche de données. Similaire au poids moléculaire moyen en poids (Mw), ces valeurs sont les plus appropriées pour caractériser l’échantillon dans son ensemble. Il convient de noter qu’un détecteur de diffusion de lumière multi-angle (MALS) découplé d’un instrument GPC/SEC fonctionnant en mode batch fournit la valeur moyenne z de Rg, Rgz.
Comment Rh et Rg sont calculés
Nous allons maintenant aborder un peu les mathématiques. D’après le modèle d’Einstein décrivant la viscosité d’une solution de particules sphériques, la relation entre Rh, masse moléculaire (M) et viscosité intrinsèque ([η]) est montrée ci-dessous (NA est le nombre d’Avogadro).
Comme la GPC/SEC calcule directement la masse moléculaire et la viscosité intrinsèque à chaque tranche de données, le Rh peut être facilement déterminé à l’aide de cette équation. Par conséquent, la limite inférieure de calcul du Rh correspond à la plus petite fraction d’échantillon pour laquelle il y a une réponse du détecteur suffisante dans les canaux d’indice de réfraction (RI), de diffusion de lumière et de viscosimètre.
Pour calculer Rg à partir de GPC/SEC, il y a deux options. La méthode directe et la plus courante consiste à observer le changement d’intensité de la lumière dispersée en fonction de l’angle d’observation. Cela nécessite un détecteur de diffusion de lumière avec au moins deux angles pour observer la dépendance angulaire de l’échantillon.
Comme mentionné dans la discussion précédente sur Rh et Rg et dans un billet récent concernant les détecteurs de diffusion de lumière, il est difficile de déterminer Rg pour les protéines en utilisant GPC/SEC car les protéines sont généralement plus petites que 10-15 nm et sont donc des disperseurs isotropes, c’est-à-dire qu’elles dispersent la lumière de manière égale dans toutes les directions. Les polymères de faible poids moléculaire sont également des disperseurs isotropes ce qui signifie que le tracé partiel de Zimm résultant est plat avec une pente de zéro, donc Rg ne peut pas être déterminé pour ces matériaux plus petits. Cela est illustré à gauche sur la Figure 1, ci-dessus.
Pour que Rg soit calculé par diffusion de lumière, la molécule doit montrer une dépendance angulaire, ce qui signifie que l’intensité de la lumière dispersée varie avec l’angle d’observation. Cela résulte en un tracé partiel de Zimm incliné, illustré par l’exemple montré à droite sur la Figure 1. La longueur d’onde de la lumière utilisée dans le détecteur de diffusion de lumière affecte le seuil de taille auquel un échantillon montre une dépendance angulaire, il est donc possible que Rg puisse être calculé pour des plages de taille plus petites en ajustant la longueur d’onde de la source de lumière.
Une autre manière de calculer Rg est d’utiliser l’équation de Flory-Fox, présentée ci-dessous, qui relie la masse moléculaire (M) et la viscosité intrinsèque ([η]) à Rg (Φ0 est traité comme une constante).
L’avantage de calculer Rg de cette manière est que, comme pour Rh ci-dessus, la limite inférieure de calcul dépend de la réponse du détecteur plutôt que de savoir si l’échantillon montre une dépendance angulaire. Le désavantage est que le terme Φ0 est en réalité dépendant de l’échantillon, du solvant, et de la structure moléculaire résultante étudiée (il est le plus approprié pour les bobines aléatoires), et donc le définir comme constant introduit un niveau d’approximation. En général, et pour le reste de ce billet, lorsque Rg est discuté, il est calculé à partir d’un détecteur de diffusion de lumière.
Différences dans les données Rh et Rg
Les données Rh et Rg disponibles pour une analyse donnée dépendent de l’échantillon spécifique en cours d’investigation. Étant donné que le calcul de Rg nécessite qu’une molécule montre une dépendance angulaire, si un échantillon est un diffuseur isotrope ne montrant aucune dépendance angulaire, il existe une possibilité que Rg ne puisse pas être déterminé. Un échantillon avec une distribution large de poids moléculaire et de taille moléculaire peut posséder de grandes fractions montrant une dépendance angulaire et de plus petites fractions ne le faisant pas. Dans ce cas, Rg ne peut être calculé que pour les molécules plus grandes d’élution antérieure.
Un exemple mettant en évidence ce comportement est présenté à la Figure 2. Les parties des données dans lesquelles les valeurs de Rh et Rg sont directement calculées sont représentées par les segments pleins des tracés vert foncé et magenta, respectivement. Les portions en pointillé des lignes indiquent les régions où les valeurs de Rh et Rg sont extrapolées. La plus petite valeur de Rg pouvant être calculée pour l’échantillon est de 11,55 nm, ce qui représente le point où les fractions d’élution ultérieures de l’échantillon sont trop petites pour montrer une dépendance angulaire. Cela laisse Rg être extrapolé pour une grande section de l’échantillon. En revanche, Rh peut être calculé jusqu’à 5,08 nm, permettant de calculer directement la taille moléculaire de la majorité de l’échantillon.
Comme Rh et Rg représentent des propriétés distinctes de l’échantillon, on ne devrait pas s’attendre à ce que les valeurs résultantes soient identiques. Cela ne signifie pas que l’un d’eux est incorrect ! Pour un type d’échantillon et un solvant donnés, il y aura probablement une relation cohérente entre les deux. Dans mon expérience avec les échantillons polymériques (puisqu’il est difficile d’obtenir des données de Rg pour les protéines), le Rg calculé est du même ordre mais un peu plus grand que le Rh déterminé (dans l’exemple de la Figure 2, Rh = 13,62 nm ; Rg = 14,19 nm). Cela ne doit pas être vrai dans tous les cas, car la relation entre Rh et Rg dépend de la structure moléculaire.
La taille moléculaire est importante pour les scientifiques pour diverses raisons. Je vous encourage à utiliser les données disponibles de la manière la plus appropriée pour vos échantillons. Et la prochaine fois que vous présenterez des données GPC/SEC et que quelqu’un vous posera des questions sur les différences entre Rh et Rg, vous serez prêt !
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