Comment la concentration d’échantillon peut affecter la forme de pic dans les données OMNISEC
De nombreux facteurs peuvent affecter la qualité de vos données OMNISEC GPC/SEC. Cela inclut des éléments tels que les méthodes d’analyse, la phase mobile et le ensemble de colonnes, mais cela peut également inclure des paramètres moins évidents tels que la concentration et le volume d’injection.
Je mentionne la concentration et le volume d’injection ensemble car ils influencent tous deux la masse d’échantillon introduite dans le système. Une injection de 100 µL d’un échantillon de 2 mg/mL charge la même quantité d’échantillon qu’une injection de 50 µL d’un échantillon de 4 mg/mL. C’est important à garder à l’esprit si vous essayez d’optimiser les conditions d’analyse, car vous pouvez utiliser le même échantillon préparé et simplement ajuster le volume d’injection au lieu de préparer plusieurs échantillons à des concentrations variées.
Quelle est la concentration idéale pour mon échantillon ?
Comme beaucoup de choses avec GPC/SEC, la réponse dépend de votre échantillon et du système. Une gamme générale de concentration d’échantillon est de 3 à 5 mg/mL ; c’est ce à quoi je vise lorsque j’analyse des échantillons pour la première fois. Si vous avez un ensemble de colonnes avec beaucoup de colonnes (plus de trois), vous pourriez avoir besoin d’injecter plus d’échantillon que prévu, car chaque colonne dilue la quantité d’échantillon passant à travers les détecteurs à tout moment. Cependant, si vous analysez un échantillon que vous savez avoir un poids moléculaire très élevé, vous devrez probablement utiliser une concentration inférieure à la gamme suggérée de 1-5 mg/mL.
Vous voulez injecter suffisamment d’échantillon pour obtenir de bons signaux de détecteur mais également vous assurer de ne pas surcharger l’ensemble de colonnes, ce qui pourrait résulter en une chromatographie inhabituelle. Pour moi, une concentration idéale d’échantillon charge la quantité minimale d’échantillon requise pour obtenir des réponses fiables dans tous les détecteurs.
Comment savoir si je surcharge l’ensemble de colonnes ?
C’est une excellente question ! L’indice le plus notable est la forme de votre pic d’échantillon.
Dans l’image ci-dessous, j’ai inclus un chromatogramme à détecteurs multiples d’un échantillon montrant un pic d’échantillon avec une épaule. Cela en soi n’est pas nécessairement une raison d’alarme ; cette forme pourrait représenter avec précision la distribution du poids moléculaire de l’échantillon.
Cependant, si vous vous attendiez à ce que votre échantillon possède une distribution plus gaussienne, vous pourriez suspecter que quelque chose ne va pas. La première chose que je ferais dans cette situation est d’inspecter l’ampleur de chaque pic, en particulier le signal de l’indice de réfraction (RI) (qui correspond directement à la concentration d’échantillon).
Dans l’exemple ci-dessus, la hauteur du pic RI est supérieure à 400 mV. Comme la forme du pic, cela en soi n’est pas nécessairement un problème. Mais cela indique qu’il y a de la marge pour diminuer la concentration d’échantillon (ou le volume d’injection) sans devenir indétectable. Cela est valable pour les autres détecteurs également.
Par conséquent, pour déterminer si l’échantillon surcharge l’ensemble de colonnes, une série de dilutions de l’échantillon a été préparée pour analyser l’échantillon à des concentrations plus faibles et surveiller tout changement de forme de pic.
Série de dilutions
En plus de l’analyse originale, trois analyses à des concentrations plus faibles ont été réalisées. Les chromatogrammes RI de ces injections sont superposés ci-dessous.
Comme prévu, l’amplitude du pic d’échantillon diminue avec chaque dilution. Et avec la première dilution, il y a un changement dans la forme du pic – l’épaule disparaît ! Cela suggère que la concentration de la première injection était trop élevée pour l’ensemble de colonnes, et une fois réduite, l’échantillon a pu être correctement séparé et la distribution gaussienne attendue a été observée.
Plot de Mark-Houwink
Pour confirmer que la structure de l’échantillon ne changeait pas avec la concentration, le plot de Mark-Houwink de toutes les quatre injections, montré ci-dessous, a été examiné.
La majorité de tous les plots se superposent bien, indiquant une structure cohérente. La linéarité des plots est comme attendu pour les polymères synthétiques linéaires où le poids moléculaire (longueur de chaîne) et la taille moléculaire augmentent à des rythmes constants par rapport l’un à l’autre.
Le plot de la première injection avec l’épaule, montré en rouge, présente un coude dans la région de faible poids moléculaire, résultant très probablement d’une chromatographie compromise.
Concentration idéale
Comme je l’ai dit précédemment, je pense que la concentration idéale est la concentration minimale requise pour obtenir des réponses fiables dans tous les détecteurs. Le chromatogramme à détecteurs multiples de la dernière injection dans la série de dilutions, montré ci-dessous, fournit de forts signaux pour tous les détecteurs sans aucune des épaulettes. Cette concentration est environ un quart de celle de la concentration initiale.
Conclusions finales
En conclusion, j’espère que cet examen de la concentration et de ses effets sur la forme de pic vous aide à devenir un utilisateur plus compétent d’OMNISEC. Si vous avez des questions, n’hésitez pas à nous contacter ou à m’envoyer un courriel directement à kyle.williams@malvernpanalytical.com.
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