聚合溫度 (Tagg) – 什麼是聚合溫度以及如何計算聚合溫度？

使用Zetasizer測量聚合溫度

在動態光散射(DLS)中，可以獲得溶液中粒子的水動力學尺寸和尺寸分佈。這項測量可能會作為時間和溫度的函數來進行研究，或者作為Malvern Zetasizer 軟體中所述的「趨勢」。對於生物蛋白樣品來說，這個溫度趨勢特別有趣：儘管在低溫下蛋白質可能穩定並顯示可重複的尺寸（和散射強度）測量值，但通常在某個較高的溫度 (T_agg)下，蛋白質分子會顯示出寡聚化或聚合的趨勢。發生這種情況的溫度將依賴於蛋白質本身以及緩衝液的組成，通常只有在開始測量時蛋白質均勻時才會清楚地觀察到。

應用說明 “使用光散射研究Recombumin的熱穩定性 – 預測保質期” 中討論了重組人血清白蛋白穩定性的例子，詳見 “Using light scattering to study the thermal stability of Recombumin – predicting shelf life“。

T_agg 如何確定？

確定聚合溫度 T_agg 的傳統方法是查看歸一化的強度相對於溫度的圖表。聚合點是斜率大於10的第一個點，其中斜率包括前5個數據點。這種方法可以修改為查看z-平均尺寸，或者甚至查看多分散性指數。當前的軟體包含兩個擬合算法：

• 單參數（僅計數率）分析
• 多參數（尺寸和計數率）分析

多參數擬合考慮了水動力學 (z-平均) 尺寸和 (衍生) 散射計數率的變化，並且是首選的方法。當前軟件的截圖顯示了兩種分析方法的典型差異。

在Example Results.dts文件中提供的血紅蛋白聚合溫度點的示例中，舊的單參數方法得出38ºC的結果，而新的多參數方法得出42ºC的結果。只要使用相同的方法比較不同的數據集，絕對變化不會有太大影響。要查看任何數據集的這個菜單，請突出顯示記錄，右鍵單擊並選擇編輯結果。

為什麼T_agg 與T_melt 不同？

聚合溫度檢測聚合的開始；即分子有聚集趨勢的溫度。而融化溫度T_melt或T_m則是（幾乎）完全變性蛋白質的結果。例如，可以通過差示掃描量熱法(DSC)或圓二色性（CD）來測定，它們可以分別檢測熱容量和總體結構的微小變化。由於光散射對於分子尺寸的微小變化和寡聚化的開始極其敏感，因此聚合溫度 (T_agg) 通常比融化溫度 (T_melt) 低。

如何設置T_agg的測量？

Zetasizer允許進行溫度對比的自動趨勢測量。要訪問菜單，可以開始手動測量或創建SOP。然後在窗口的左上角選擇測量類型 – 趨勢 – 溫度 – 尺寸，這將從一些默認設置開始。瀏覽菜單項，特別是趨勢序列，其中可以輸入開始和結束溫度以及溫度間隔。勾選「檢查聚合點」旁邊的選項。在「尺寸測量」設置下，提供每一步的平衡時間。我建議勾選「允許僅保存包含相關數據的結果」，即使樣品聚集得相當嚴重（即超過聚合溫度）時也可以保存數據，這可能會有用。

SOP預估試驗長度，這會顯示在趨勢和尺寸測量部分（可能需要點擊其他地方更新計算）。然後SOP或手動測量可以像常規測量一樣開始。

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