最佳實踐：等溫滴定量熱法研究結合相互作用 – 第三部分

經過 Verna Frasca, Tuesday, 19th March 2019

以下是使用MicroCal PEAQ-ITC、VP-ITC和iTC200系統進行傳統結合實驗的最佳實踐。這是前面博客“最佳實踐：等溫滴定量熱法研究結合相互作用”第一部分和第二部分的延續。

圖1：（頂部）原始ITC數據，包括控制滴定（配體對緩衝液）（紅色）和結合實驗（配體對大分子）（黑色）。注意，控制滴定的峰值在形狀和大小上類似於結合實驗的最後幾次注射。

（底部）標準化的熱變化，包括控制滴定（紅色）和結合實驗（黑色）。數據符合一組位點結合模型。

參見圖1和圖2。

滴定數據圖開始時出現一系列近乎相等的高峰（放熱或吸熱），表示配體與大分子幾乎達到100%結合
隨著實驗中配體注射的進一步綁定點飽和，熱變化減小
當結合完全飽合後，對應於配體稀釋熱的最終峰值應該是小的且可重複的（圖1和圖2）
這種滴定曲線將導致一個S形結合等溫線（圖1底部）
需要在基線噪音之上有足夠的熱變化以獲得高質量的ITC數據
注射的熱量（積分區域）：
- 對於PEAQ-ITC和ITC200：第二個（第一個完整）峰值大於2.5 ucals是理想的
  - 第二個峰值約為1 ucals是數據分析的最小熱量
- 對於VP-ITC：第二個（第一個完整）峰值大於10 ucals是理想的
  - 第二個峰值約為3-5 ucals是數據分析的最小熱量
- 低於這個熱檢測範圍，數據會由於較低的信號/噪音比而變得更加嘈雜
原始ITC數據的基線位置（在ucal/sec中）應在參考功率設置的1 ucal/sec以內。如果差異大於1 ucal/sec，可能表示ITC單元髒或參考或樣品單元中有氣泡
原始ITC數據的所有DP值（Y軸）應大於0 ucal/sec
注射後的基線位置應與注射前的基線相同。如果不是，可能是注射間的時間不夠，或者有其他過程導致DP變化，如酶促水解
在整個滴定過程中基線的輕微漂移是正常的。如果有好的積分基線，數據是好的（圖2）。不想要基線中的大跳躍或“臺階”

圖2。高質量的ITC數據。注意整合基線的輕微漂移（紅色）——這是可以接受的。

N與總大分子濃度相關，是在數據分析過程中確定的參數之一。重要的是要理解，ITC N值並不總是等同於配體與大分子結合的化學計量比（結合比）。事實上，如果我們使用的濃度正確且100%活性，那麼N值確實等於化學計量比。

另一種表達N值的方法是這個公式：

N = St x [AF_cell/AF_syr]

其中St是化學計量比（大分子對配體的結合位點數），AF是生物分子的“活性部分”（活性濃度除以總濃度），AF_cell是細胞中樣品的活性部分（通常是大分子），AF_syr是注射器中樣品的活性部分（通常是配體）。

這個方程中的任何三個值都可以改變N，這意味著N是樣品結合比和活性的一種度量。需要知道（或假設）其中兩個值才能得到第三個。例如，如果對化學計量比感興趣，那麼擬合中提供的濃度必須是準確和100%活性的。如果對細胞中樣品的活性（通常是大分子）感興趣，則必須假設注射器中樣品的化學計量比和活性濃度（配體）。

在PEAQ-ITC數據分析軟件包中，您還可以通過將N固定為1（或所需值）並改變細胞或注射器濃度來擬合數據。

如果N低於預期化學計量比，則細胞內活性大分子濃度低於總濃度，和/或活性配體濃度高於總濃度。

如果N為0.5，您的大分子（在ITC細胞中）可能是二聚體，並且每個二聚體結合一個配體。您的注射器中的生物分子也可能有兩個結合位點，而細胞中的樣品有一個結合位點，因此您應該嘗試使用“細胞中的配體”選項來擬合結合曲線。

如果N高於預期化學計量比，則您的細胞中活性大分子濃度大於總濃度，和/或活性配體濃度低於總濃度。

注射器中配體濃度的錯誤會導致N、K_D和ΔH測量的誤差，因此計算出的自由能（ΔG）和熵（-TΔS）在結合中的貢獻也會有誤差。細胞中的大分子濃度錯誤主要影響確定N值的準確性。

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