最佳實踐：使用等溫滴定量熱法研究結合交互作用——第4部分

經過 Verna Frasca, Thursday, 18th April 2019

以下是使用 MicroCal PEAQ-ITC，VP-ITC 和 iTC200 系統進行傳統結合實驗的幾個最佳實踐。這是之前博客《使用等溫滴定量熱法研究結合交互作用》的延續，第1部分，第2部分和第3部分。

ITC 原始數據的常見問題及可能原因

  • 注射熱量大，這是因為稀釋熱較大：

    • 通常由於大分子和配體溶液不匹配，這遠大於實際的結合熱。
    • 結合等溫線通常看起來像一條直線，沒有飽和結合的跡象。
    • 通常這種大熱量變化無法通過減去一個對照滴定來校正。

  • DP 無法在下一次注射前返回到注射前基線。

    • 這可能是因為注射間的時間不足以進行完整的結合熱量測量。
    • 每次注射的熱量變化未測量完全，影響數據質量。調整注射體積、降低配體濃度和/或延長注射間時間。
    • 如果在實驗過程中注意到這個效果，可以增加後續注射間的間隔時間。
    • 還可能有其他（較慢的）過程導致熱量變化，如構象變化。

  • 注射峰值突發，有些峰值遠大於（或遠小於）其他峰值：

    • 由 ITC 單元格或注射器內的氣泡，或 ITC 注射器的髒污或損壞的活塞尖端引起。

  • 基線噪聲和/或注射間的峰值突發：

    • 由於單元格和/或注射器填充不良、單元格和/或注射器污漬導致的氣泡。
    • 也可能是由於注射針彎曲或注射系統問題引起。

  • 階梯式基線：系統的熱容有變化，由於酶水解、pH或緩衝液不匹配：

    • 如果研究底物和酶之間的結合，請使用不可水解的底物。
    • 階梯式基線也可能是由於 ITC 單元格或注射器中的氣泡，由填充不足引起。

  • 無法檢測到結合熱：

    • 沒有結合發生。
    • 可能結合正在發生，但熱變化太低。結合焓可能低於預期，和/或結合親和力比預期弱。
    • 要增加熱變化/注射，需要增加大分子和/或配體的濃度；增加注射體積，和/或改變實驗條件，如實驗溫度或緩衝液/pH。

在數據分析之前校正稀釋熱

  • 正如在之前的博客中所討論的，重要的是要使大分子和配體溶液緊密匹配，以避免大稀釋熱，這可能掩蓋實際的結合信號。這些非結合相關的熱量需要在進一步數據分析之前從大分子-配體滴定結合等溫線的每個點中減去。這可以通過幾種方式完成：
  • 可以直接從實驗滴定中通過對最後幾次注射的整合熱量平均來估算稀釋熱。此減法可以在 Origin 數據分析中使用“簡單數學”選項完成。此方法假設在 ITC 實驗結束時結合位點已經被配體充分飽和。
  • 對於 PEAQ-ITC，還可以在數據分析中使用“擬合偏移”選項來校正稀釋熱。
    • 如果您有配體溶液進入緩衝液的對照滴定，則可以將這個對照中每個點的整合峰值與實驗中的整合峰值逐一相減。對於小結合熱，這種校正可能會導致比減去一個常數更嘈雜的結合等溫線。
  • 注意，控制滴定應在整個滴定過程中產生可再現的注射熱量，並產生無或淺斜率的線性圖（圖1）。
  • 而不是逐點校正，您可以創建一條線或者獲得控制滴定的平均注射熱變化，然後從實驗數據中減去。
  • 如果實驗結合曲線的最後幾次注射具有非零斜率，和/或對照滴定是非線性的或具有大的斜率，您應考慮造成這種結果的可能原因及是否可以適當地加以校正。
  • 當用上述方法之一考慮稀釋熱後，飽和結合時的結合焓應接近零，並且可以使用適當的模型擬合結合等溫線以確定結合參數。

圖1：原始 ITC 數據，帶有對照滴定（配體進入緩衝液）（紅色），和結合實驗（配體進入大分子）（黑色）。注意對照滴定的峰形與結合實驗的最後注射相似。

圖1：歸一化的熱變化，帶有對照滴定（紅色），和結合實驗（黑色）。數據擬合到一組位點結合模型。[/caption>

首次實驗後的 ITC 實驗優化

  • 可以通過調整細胞樣品和/或注射樣品的濃度來改變結合等溫線的形狀，從而優化獲得的數據質量。您還可以更改注射體積和注射次數。如果您有初步數據，可以使用“設計實驗”嚮導高級選項或其他 ITC 數據模擬工具來模擬結合等溫線並設計未來的實驗。
  • 您可能無法使用“最佳”濃度進行結合：非常低的反應物濃度可能會產生過小的實驗信號（這取決於結合的 ΔH），而非常高的濃度可能對生物聚合物來說是不切實際或無法達到的（例如，如果蛋白質在高濃度時傾向於聚集）。
  • 如果您無法將配體濃度提高到足以在注射完注射器體積內容物後達到飽和結合的程度，可以將大分子-配體複合物保存在 ITC 單元格中，再次填充注射器更多的配體，並執行第二次滴定實驗。這可以重複進行直到達到結合飽和。
  • 如果結合親和力和大分子濃度的結果在最佳範圍之外怎麼辦？對於非常緊密的結合反應（C 值> 1000 的情況可能性大）僅能從 ITC 實驗中直接準確確定 ΔH 和 N。附加的方法，如使用預先結合的弱結合配體進行置換/競爭實驗，仍然可能允許用戶確定 KD。
  • 對於弱結合事件，仍然可以通過在“低 C 範圍”內工作（C 值低於 1-5）來獲得有用數據，方法是使用非常高濃度的配體驅動結合在滴定結束時接近飽和。在這種情況下，結合等溫線往往是非 S 型的，可能在擬合過程中需要固定 N，因此只有結合親和力可以被有信心地測量。 ΔH 不會在實驗中被很好地定義。但在 N 已知確定無疑的情況下，可以在擬合過程中固定 N，這種情況仍然可以提供非常有價值的信息。您還可以進行旨在表徵弱結合物的置換/競爭實驗。

相關內容

早期文章

“`

這篇文章可能已自動翻譯