Rh 或 Rg：哪個適合我的 GPC/SEC 樣品？
在使用凝膠滲透/排阻色譜（GPC/SEC）時，主要目標通常是確定大分子樣品的分子量。Malvern Panalytical 的 多檢測器系統（如 OMNISEC 和 TDAmax 系統）能夠提供一系列的其他分子表徵參數，包括分子尺寸。在某些情況下，例如分析蛋白質或其他已知分子量的樣品時，分析的唯一目的是確定樣品的分子尺寸。在這些情況下，分子尺寸可以揭示樣品分子結構的關鍵資訊，這通常與樣品的最終功能或應用密切相關。
通過 GPC/SEC 分析有兩種常見的分子尺寸測量方法：流體動力學半徑（Rh）和迴轉半徑（Rg）。之前的帖子描述了如何使用蛋白質表徵中的 Rh 和 Rg進行動態光散射（DLS）和小角 X 射線散射（SAXS）。本文將討論 Rh 和 Rg 的定義、如何在 GPC/SEC 背景下計算這兩者以及這些差異的實際影響。欲了解更多詳細資訊（以及更多公式！），請參閱這些鏈接的文件.
Rh 和 Rg 的定義
不深入數學（目前還不深入），樣品的 Rh 是一個理論球體的半徑，該球體的質量和密度與從其分子量和本徵黏度中計算得出的樣品相同。Rg 代表分子組成成分到分子質心的均方根距離。由 GPC/SEC 分析生成的單一 Rh 和 Rg 數值是從編譯每個數據切片的計算值中獲得的重量平均值。類似於重量平均分子量（Mw），這些值最適合用於表徵整個樣品。需要注意的是，與 GPC/SEC 儀器解耦的多角度光散射（MALS）檢測器在批量模式下提供 z 平均 Rg 值，即 Rgz。
Rh 和 Rg 如何計算
現在，我們將稍微涉及數學。根據愛因斯坦描述球形粒子溶液黏度的模型，Rh、分子量（M）和本徵黏度（[η]）之間的關係如下（NA 是阿伏伽德羅常數）。
由於 GPC/SEC 直接計算每個數據切片的分子量和本徵黏度，因此可以使用此方程式輕鬆確定 Rh。因此，Rh 計算的下限與 RI、光散射和黏度計通道中的檢測器響應充足的最小樣品分數相符。
要從 GPC/SEC 計算 Rg，有兩種選擇。最直接且最常用的方法是觀察隨觀察角度變化的散射光強度。這需要具有至少兩個角度的光散射檢測器來觀察樣品的角度依賴性。
如在 之前的 Rh 和 Rg 討論中提到的，及最近的一篇有關光散射檢測器的帖子中提到，使用 GPC/SEC 難以確定蛋白質的 Rg，因為蛋白質通常小於 10-15 nm，因此它們是各向同性散射體，即它們在所有方向上均勻散射光。低分子量聚合物也是各向同性散射體，這意味著結果部分 Zimm 圖是平坦的，具有零斜率，因此不能為這些較小的材料確定 Rg。如圖 1 左圖所示。
要通過光散射計算 Rg，分子必須顯示角度依賴性，這意味著散射光強度隨觀察角度的變化而變化。這導致部分 Zimm 圖產生斜率，見於圖 1 右側示例所示。光散射檢測器中使用的光波長影響樣品顯示角度依賴性的尺寸閾值，因此可以通過調整光源波長來計算更小尺寸範圍的 Rg。
計算 Rg 的另一種方法是使用下面展示的 Flory-Fox 方程，該方程將分子量（M）和本徵黏度（[η]）與 Rg（Φ0 被視為常數）相關聯。
這種計算 Rg 的方法的優點在於，如上所述的 Rh，其計算下限取決於檢測器響應，而非樣品是否顯示角度依賴性。其缺點是項目 Φ0 實際上取決於樣品、溶劑以及研究中的分子結構，因此將其依賴於常數引入了近似級別。總的來說，並且在本文的其餘部分中，談到 Rg 時，通常是從光散射檢測器中計算得出的。
Rh 和 Rg 資料的差異
對於特定樣品進行的分析中可獲得的 Rh 和 Rg 資料取決於調查中的特定樣品。由於 Rg 計算要求分子顯示角度依賴性，如果樣品是各向同性散射體且沒有顯示角度依賴性，則 Rg 可能無法確定。具有廣泛分佈的分子量和分子尺寸的樣品可能具有顯示角度依賴性的較大部分和不顯示的較小部分。在這種情況下，Rg 只能算出提前洗脫的較大分子。
圖 2 中顯示了一個突出此行為的示例。資料中的 Rh 和 Rg 值直接計算的部分，分別由深綠色和品紅色圖的實線段表示。虛線部分指示 Rh 和 Rg 值外推的區域。可以為樣品計算出的最小 Rg 值為 11.55 nm，這表示樣品晚洗脫部分太小以至於不能顯示角度依賴性。因此，Rg 被外推以適用於樣品的較大部分。相反，Rh 可以計算到 5.08 nm，使得大多數樣品的分子尺寸可以直接計算。
由於 Rh 和 Rg 代表樣品的單獨屬性，因此不應期望結果值會相同。這並不意味著其中一個是錯誤的！對於特定樣品類型和溶劑，Rh 和 Rg 之間可能存在一致的關係。根據我在聚合物樣品中的經驗（因為難以獲得蛋白質的 Rg 資料），計算的 Rg 與確定的 Rh 處於相同級別但略大（如圖 2 所示的示例中 Rh = 13.62 nm；Rg = 14.19 nm）。這在所有情況下不必然如此，因為 Rh 和 Rg 之間的關係取決於分子結構。
分子尺寸對科學家來說因多種原因而重要。我鼓勵您以最適合您的樣品的方式使用可用的數據。下次當您展示 GPC/SEC 資料並有人詢問 Rh 和 Rg 之間的差異時，您就準備好了！
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