哪種光散射檢測器適合我？
確定哪種凝膠滲透/體積排阻色譜 (GPC/SEC) 系統最符合您的需求可能是一項艱巨的任務。即使在決定通過光散射檢測器來獲取絕對分子量數據後，您仍然需要在兩個選項之間做出選擇：多角度光散射 (MALS) 檢測器或直角和低角光散射檢測器 (RALS/LALS)。這兩種光散射配置都會提供樣品的絕對分子量，但採用不同的方法來達到相同的目標。幸運的是，Malvern Panalytical 提供兩者；這包括模組化的SEC-MALS 20單元，可連接至OMNISEC、TDAmax，或其他第三方系統，以及整合的RALS/LALS檢測器在OMNISEC和TDAmax全包GPC/SEC系統中。在這篇文章中，我將討論MALS和RALS/LALS檢測器，並希望提供相關資訊，讓您決定哪種配置最適合您和您的應用。
首先，我們將往回探討一些光散射的理論(如需更詳細的靜態光散射討論，請參閱我們之前發表的白皮書)。光散射檢測器的工作原理是，分子散射的光強度與其分子量成正比。分子量越高，散射光的強度越大。這種關係由下方的瑞利方程指出，其中Rθ表示在給定角度θ的散射光強度，Mw是樣品的分子量。
此外，觀察的角度也會影響光散射。半徑在10-15 nm或更小的樣品稱為等向散射體，即它們在所有方向上的光散射強度相同。這意味著在90°檢測器觀察到的光強度與在15°、45°、135°等放置的檢測器觀察到的光強度相同。大於這一10-15 nm範圍的樣品受到干擾的影響，因為樣品足夠大，可以在到達檢測器之前多次散射光。結果是對於大樣品，散射光的強度會隨著觀察角度的不同而變化。散射光強度的角度依賴性意味著可以根據檢測器的放置位置計算不同的分子量。為了最小化干擾的影響，觀察大樣品散射光強度的最佳角度是0°。從實際操作的角度來看，這是不可能的，因為檢測器無法區分樣品散射光和入射光束的光。對此問題的解決方案——以0°觀測散射光強度——由MALS和RALS/LALS檢測器配置提供。
MALS檢測器通常在樣品流動池周圍以不同的角度佈置三到二十個檢測器。通常包括一個90°檢測器，其他檢測器的角度範圍從12°到168°不等。MALS檢測器在多種角度測量散射光，將數據擬合到模型，然後回推至0°以確定樣品的分子量。如果樣品是等向散射體，則每個數據點都會代表相同的光散射強度，回推至0°的外推線將是一條平坦的直線。如果樣品足夠大以顯示角度依賴性，那麼根據觀察角度的不同，散射光強度的差異將變得明顯。兩個例子在下面的部分Zimm圖中顯示。
部分Zimm圖顯示MALS響應的不同角度；左：等向散射樣品在所有角度顯示相同強度；右：顯示角度依賴性的樣品，圖中的斜率為證據
RALS/LALS檢測器的安排由90°和7°檢測器組成，巧妙地選擇這些角度是因為它們具有互補性。對於半徑在10-15 nm及更小的樣品而言，90°檢測器是理想的選擇，因為它位於入射光束的直角，提高信噪比。由於較小的樣品在所有方向上的散射光強度相同，RALS檢測器提供了理想的響應以直接測量樣品的分子量。對於顯示角度依賴性的半徑大於10-15 nm的樣品，LALS檢測器在7°的位置提供了測量，它是可用的最低檢測器位置。7°的放置意味著檢測器基本上是對樣品的分子量進行直接測量，避免了任何擬合和外推的需求。值得注意的是，LALS檢測器對所有尺寸的樣品都是準確的，但由於小型、低分子量樣品提供的散射光強度較低，RALS透過與入射光源正交的放置提供了更乾淨的信號。
部分Zimm圖顯示分子量的直接測量；左：90° RALS響應測量顯示等向散射的樣品；右：7° LALS響應測量顯示角度依賴性的樣品
要確定最符合您需求的光散射檢測器，您需要考慮您的應用、您所尋求的資訊以及個人偏好。MALS和RALS/LALS檢測器都有其優勢和劣勢，可能更適合某種情況，但好消息是，這兩者都能提供準確的結果！
例如，如果您的主要分析對象是相對較大的、高分子量的樣品，那麼MALS和RALS/LALS檢測器配置旨在處理您樣品中存在的整個分子量範圍。然而，如果您主要是對小型、低分子量的材料進行分析，那麼RALS檢測器將能夠處理大多數您的分析。擁有一個互補的LALS檢測器將確保您的樣品中的任何大部分或潛在的聚集物被準確觀察到，即使它們在您的樣品中存在於低濃度。MALS檢測器可以確定正確的分子量，但因為對於小型、等向散射的樣品，所有檢測器都將觀察到相同的散射光強度，導致多次獲得相同的結果，這可能會變得多餘。
上述例子通常適用於研究蛋白質的科學家。由於它們的結構的有序性，蛋白質是相對密集的分子，這意味著即使是高分子量的物種也相對較小。即使是分子量高達700 kDa的蛋白質也僅有10-12 nm的半徑。高分子量但相對小的分子尺寸的潛力意味著蛋白質通常是等向散射體，是RALS/LALS檢測器的理想樣品。在這種情況下，RALS檢測器將是用於計算的主要檢測器，LALS檢測器則負責檢測樣品中的聚集體或較大的成分。由於蛋白質通常是等向散射體，因而使用MALS檢測器中包含的多個角度檢測器無法提供額外的益處。
為了說明這一點，使用RALS和MALS檢測器測量了幾種蛋白質的分子量。下圖中顯示的數據清楚地表明，從兩個檢測器中獲得了相同的分子量。這證實了對於顯示等向散射的樣品，RALS檢測器提供與MALS檢測器相同的結果。
使用RALS和MALS檢測器計算的蛋白質分子量；分子量以kDa為單位
如果您不僅對分子量感興趣，還對分子尺寸感興趣，那麼MALS檢測器提供了計算樣品旋轉半徑 (Rg) 的能力。然而，有一個警告：這僅適用於半徑大於10-15 nm的樣品，因為Rg是從部分Zimm圖中由角度依賴性產生的斜率計算得出。如果樣品是等向散射體，則沒有斜率，無法確定Rg。此外，通過將流變計檢測器的內在黏度(IV)數據與光散射檢測器獲得的分子量數據結合，可以確定尺寸小到幾納米的樣品的水力半徑(Rh)。
另外，您可能還需要考慮與您的應用相關的一些實際事項。如果您整合了多個檢測器，特別是對於UPLC應用，例如，RALS/LALS檢測器中的較小流動池可能會帶來好處。或者，如果您以前曾遭遇光散射池污染，那麼您可能會發現某種特定的池定位(例如在SEC-MALS 20中的垂直流動池)額外提供的穩健性和可靠性。
當然，個人偏好在選擇光散射檢測器時始終是一個因素。或許您一直使用MALS檢測器，並且更熟悉於使用特定的外推模型來計算分子量。又或者，您偏好RALS/LALS方法提供的簡單性和直接性來計算分子量，又或許您的預算有限，想要最大化地使用您的儀器。
我想快速評論這最後一點，因為這是每個人都能夠理解的問題。這些檢測器單元的成本隨著每個光散射檢測器的數量增加而增加。在RALS/LALS配置中有兩個檢測器；在SEC-MALS 20中則有二十個。價格相應地有所不同。擁有MALS檢測器中各種角度範圍沒有實際的劣勢，但如前所述，對於等向散射體，附加的角度並不總是提供額外的信息。
即便如此，您仍然可以在同一系統中安裝MALS和RALS/LALS檢測器，同時收集數據，然後在數據分析過程中決定使用哪一種進行計算，即便這不是最具成本效益的路徑。
希望我在這篇文章中提供了足夠的信息幫助您決定MALS或RALS/LALS檢測器(或兩者)是否最適合您和您的應用。無論您選擇哪一種，我們都能滿足您的需求！
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