Visualisierung, Größen- und Mengenbestimmung von Medikamentenabgabesystemen unter Verwendung der Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

Die Anwendung von Nanopartikeln für die Medikamentenabgabe nimmt rapide zu. Nanopartikel bieten ausgezeichnete pharmakokinetische Eigenschaften, eine kontinuierliche und kontrollierte Freisetzung sowie die Möglichkeit, gezielt Zellen, Gewebe oder Organe anzusprechen. Das wachsende Interesse an der Medikamentenabgabe mittels Nanopartikeln liegt auch daran, dass die Entdeckung neuer biologisch aktiver Verbindungen, die als Behandlungsmethoden genutzt werden können, zur Krankheitsbehandlung verlangsamt wurde. Da die Anzahl neuer Medikamente, die jährlich auf den Markt kommen, zurückgeht, steigt das Interesse, die vielseitig einsetzbaren und multifunktionalen Strukturen von Nanopartikeln für die Medikamentenabgabe zu nutzen, rapide an. All diese Merkmale können die Wirksamkeit bestehender Medikamente verbessern.

Nanopartikel, die für die Medikamentenabgabe genutzt werden, sind als Kolloide unter 1 Mikrometer definiert, die aus einer Vielzahl von Materialien unterschiedlicher Zusammensetzung hergestellt werden können. Allgemein definierte Nanopartikel-Vektoren umfassen Liposomen, Mizellen, Dendrimere, feste Lipid-Nanopartikel, Metall-Nanopartikel, Halbleiter-Nanopartikel und Polymer-Nanopartikel. Nanopartikel werden in großem Umfang angenommen, um Arzneimittel, Gene, Impfstoffe und zur Diagnostik an spezifische Zellen oder Gewebe abzugeben.

Bei der Betrachtung eines nanoskaligen Arzneimittelabgabesystems ist die Größe der Nanopartikel ein wichtiger Parameter, da sie die Abgabe, Absorption, den Abbau und die Ausscheidung aus dem Körper direkt beeinflusst. Beispielsweise können Nanopartikel mit einem Durchmesser von 30 nm bis mehreren Hundert nm aufgrund einer undichten Gefäßstruktur passiv an Tumorstellen akkumulieren, während Phagozyten Partikel mit >500 nm bevorzugen, während im Verdauungstrakt Partikel <30 nm nicht akkumulieren und in den Nieren Partikel <8 nm durchdringen. Zudem nimmt die Leber kleinere Partikel (25 nm und 50 nm) im Vergleich zu größeren Partikeln (200 nm und 300 nm) weniger auf. Daher ist es entscheidend, die Größe der verabreichten Partikel entsprechend den verschiedenen Systemen und Prozessen genau zu messen.

Analyse von Medikamentenabgabesystemen mit NTA (Nanoparticle Tracking Analysis)

Liposomen

Liposomen (Abbildung 1) wurden über viele Jahre hinweg intensiv erforscht und entwickelt und sind heute das am häufigsten verwendete gezielte Arzneimittelabgabesystem. Liposomen sind für die Abgabe von Amphotericin B bei pilzlichen oder protozoalen Infektionen, Doxorubicin zur Behandlung von Brustkrebs und als Abgabesystem für Hepatitis A- und Influenza-Impfstoffe zugelassen. Die Bedeutung und das Potenzial der Verwendung von Liposomen in Abgabesystemen nehmen weiterhin zu. Der Grund dafür ist offenkundig.

Abbildung 1

• Therapien, die durch Liposomen abgegeben werden, können das Medikament während des Stoffwechselfolgeprozesses vor enzymatischer Spaltung schützen.
• Mithilfe von Liposomen können fettlösliche Substanzen in wasserlösliche umgewandelt werden.
• Durch das Anheften spezifischer Liganden an Liposomen kann eine gezielte Therapie bestimmter Körperregionen durchgeführt werden.
• Liposomen können leicht von Zellen aufgenommen werden.
• Die Freisetzungsrate kann durch die Wahl der Liposomen kontrolliert werden.
• Wenn Liposomen als Trägersystem verwendet werden, kann die Dosis oder Häufigkeit reduziert werden, was die Toxizität und Nebenwirkungen verringern kann.
• Liposomen können biologische Materialien wie Proteine und DNA transportieren.

Die Größe der verwendeten Liposomen wird zunehmend als ein Schlüsselelement für die therapeutische Wirksamkeit erkannt. Die Größe der Liposomen, die in der Medikamentenabgabe verwendet werden, beeinflusst deren Kreislauf- und Verweildauer im Blut, die Wirksamkeit des Ziels und die Aufnahmerate durch Zellen (oder die Aufnahme zellfremder Substanzen) und kann somit Auswirkungen auf den Erfolg der Abgabe haben. Diese Überlegungen zur Größe sind für alle nanoskaligen Arzneimittelabgabesysteme von großer Bedeutung.

Messung der Liposomengröße mittels NTA (Nanoparticle Tracking Analysis)

NanoSight-Geräte messen schnell und präzise die Größe und Konzentration von Liposomen, die in Wasser und anderen Lösungsmitteln suspendiert sind.

Es sind nur geringe Mengen und eine minimale Probenvorbereitung erforderlich. Mit diesem Gerät können Liposomen in Suspensionen individuell visualisiert und ihre Brown’sche Bewegung verfolgt werden, um innerhalb weniger Sekunden die Partikelgrößenverteilung zu bestimmen.

Echtzeit-Multiparameteranalyse von Nanopartikeln

NTA kann zusätzlich zur Größe und Konzentration auch Informationen über Partikel nach folgenden Parametern bieten:

• Streuintensität zur Unterscheidung von Partikeln nahegelegener Populationen und von Materialien mit stark unterschiedlichen Brechungsindizes.
• Dank dieser einzigartigen Funktion können Benutzer untersuchen, ob sich Nanopartikelstrukturen, die zur Arzneimittelabgabe wie Liposomen dienen, in ihrem Inhalt unterscheiden. Beispielsweise können leere Liposomen einen niedrigeren Brechungsindex (Streufähigkeit des Lichts) haben als Liposomen mit stark brechenden Materialien. So können sie auch bei sehr ähnlichen Größen differenziert werden.
• Die Fluoreszenzdetektionsfunktion ermöglicht die Identifizierung und Klassifizierung von Partikeln in einem komplexen Hintergrund. Die Fluoreszenzfunktion von NanoSight wird in weiteren Anwendungshinweisen erläutert.
• NTA wurde in der photodynamischen Krebstherapieforschung eingesetzt, um die Auswirkungen von Serum auf die Stabilität verschiedener Liposomenstudien zu untersuchen (Reshetov et al., Photochem Photobiol. September-Oktober 2012, 88(5):1256-64. doi: 10.1111/j.1751-1097.2012.01176.x).

Verwendung von NTA in anderen Medikamentenabgabesystemen

PBAE (Poly β-Aminoester) kann als Trägersystem für Gentherapie zur Behandlung verschiedener Krebsarten dienen. PBAE bietet im Vergleich zu anderen Systemen den Vorteil, dass über einen Kombinationsweg verschiedene Polymerbindungen mit DNA ermöglicht werden. Es besitzt auch schnelle Freisetzungseigenschaften durch Hydrolyse, was jedoch auch zu Problemen in Bezug auf Dosierungsänderungen und bei der Herstellung und Lagerung führt. Lyophilisierung ist eine gängige Lagermethode, und NTA wurde verwendet, um die Auswirkungen der Lyophilisierung auf die Aggregation (Größenzunahme) und den Abbau (Größenreduktion) von PBAE-DNA-Nanopartikeln zu bewerten (Tzeng et al., 2011 und Sunshine et al., 2012).

PLGA (Poly-Lactid-co-Glycolsäure) ist ein von der FDA zugelassenes Arzneimittelabgabesystem. PLGA wird abgebaut zu Milchsäure und Glycolsäure, die beide Endpunkte des Stoffwechselweges im Körper sind. PLGA wurde als Medikamentenabgabesystem nicht nur für Amoxicillin, sondern auch für die Behandlung von fortgeschrittenem Prostatakrebs mit einem die Freisetzung von GnRH (gonadotropin-releasing hormone) hämmen, eingesetzt. Zur Reduzierung der Dosierung und der damit verbundenen toxischen Nebenwirkungen wurde Mycophenolsäure, ein Immunsuppressivum, in PLGA verkapselt. NTA wurde zur Bestimmung der Größe der Nanopartikel verwendet, ein wichtiger Parameter zur Gewährleistung der korrekten Freisetzung und für die Vergleichbarkeit von Ergebnissen in der Forschung (Shirali et al., 2011).

Die erfolgreiche Bewegung von Molekülen zwischen Zellmembranen ist der Schlüssel zur Abgabe. Moleküle allein können in der Regel nicht in Zellmembranen eindringen, weshalb ein effektives Trägersystem erforderlich ist. Sokolova et al., mehrere Autoren (2012) verwendeten NTA, DLS (Dynamische Lichtstreuung) und EM (Elektronenmikroskop), um Calciumphosphat (Durchmesser: 100 nm – 250 nm, abhängig von der Funktionalisierung) als vielseitiges Trägersystem für die Abgabe großer und kleiner Moleküle zwischen Zellmembranen zu untersuchen.

Ohlsson et al., mehrere Forschergruppen (2012) berichteten über die Solutbewegung innerhalb von weniger als 100 Millisekunden zwischen der Lipiddoppelschichtzellmembran einzelner Proteoliposomen, um die Stabilität und Integrität der Liposomen zu überprüfen.

Ghonaim und Kollegen haben umfassend über die Auswirkungen chemischer Modifikationen von Lipopolyamin und Spermin auf verschiedene nicht-virale Plasmid-DNA- und siRNA-Abgabesysteme berichtet (Ghonaim et al., 2007a, Ghonaim et al., 2007b, Ghonaim et al., 2007c, Ghonaim, 2008, Ghonaim et al., 2009, Soltan et al., 2009, Ghonaim et al., 2010). Ebenso haben Ofek et al., mehrere Forschergruppen (2010) NTA übernommen, um die Eigenschaften dendritischer Nanocarrier für die siRNA-Abgabe zu analysieren. Bhise verwendete NTA zur Messung von Partikelgröße und Größendistribution in der Polymerstudie zur Gentherapie bei Zellkulturen (Bhise et al., 2010). Bhise erweiterte kürzlich diese Studie, um eine Analyse zur Quantifizierung der Zahl von Plasmiden in Nanopartikeln durchzuführen, die in Polymer-Nanopartikeln verkapselt sind, und nutzte NTA zur Messung der Plasmiddichte pro Nanopartikel von 100 nm (Bhise et al., 2011).

Wei et al., Forscherinnen und Forscher (2012) bestätigten die Notwendigkeit einer robusten Methode zur präzisen Analyse der Größe, Form und Zusammensetzung von Nanopartikeln sowie die Partikeltechnik, um die nicht-spezifische Zelltoxizität auf niedrigem Niveau zu halten und die Stabilität während der Lagerung zu verbessern, um Nanomedikamente zu entwickeln und voranzubringen.

Auch andere Beispiele zur Größenmessung von Nanopartikel-Medikamentenabgabesystemen mittels NTA und deren Anwendung wurden berichtet (Hsu et al., 2010, Park et al., 2010, Tagalakis et al., 2010).