Der Weg zum Kalorimeterrmeister Vol.1 (Fortsetzung) Was ist ein Mikrokalorimeter?

von Malvern Panalytical, Monday, 15th June 2015

Nakamura: „Im Seminarunterlagen sind ITC und DSC, jeweils mit einer kurzen Zusammenfassung der Hauptmerkmale und Messbeispiele, so dass ich ungefähr verstanden habe, welche Daten man erhält und welche Informationen daraus gewonnen werden können. Aber es scheint, dass nicht erklärt wird, wie man tatsächlich misst … Lass uns mal mit ITC anfangen. iTC200…“

Malvern’s MicroCal iTC200… da ist es…

MicroCal iTC200 Webseite

※Der Verkauf des iTC200 wurde zum 31. März 2017 eingestellt.
Bitte beachten Sie das derzeit erhältliche PEAQ-ITC.

Oh, da gibt es auch einen Film. Es wird kontrolliert, dass die Temperaturdifferenz zwischen der Probenzelle und der Referenzzelle ausgeglichen wird, wenn die Probe in der Probenzelle reagiert und Wärme erzeugt. Der Signalabfall bei exothermen Reaktionen bedeutet wohl, dass die Temperatur der Probenzelle gesenkt wird. Aha, das könnte aber stark von der Umgebungsluft beeinflusst werden. Funktioniert das mit Klimaanlagen?

Es scheint auch eine Erklärung des Prinzips zu geben.

Diese Daten sieht man häufig in wissenschaftlichen Arbeiten. Aber wie bestimmt man von diesen Daten die Dissoziationskonstanten?
Wird KD durch die Tangente bestimmt?

ΔH, die Enthalpie, ist der Wert auf der Y-Achse, oder? Hm? Die Einheit auf der Y-Achse hat sich geändert. Es wird die Wärmemenge pro Mol titrierter Probe gezeigt.

Könnte es auf der technischen Seite ausführlicher beschrieben sein?
Lass uns nachsehen.

Technikseite zur isothermen Titrationskalorimetrie

„Letztlich wird jeder Peak integriert und gegen das Mole Ratios von Ligand zu Protein aufgetragen. Die resultierende isotherme Titrationskurve wird mit einem Bindungsmodell angepasst, aus dem die Affinität (KD) abgeleitet wird.“ Dies bedeutet, dass die Dissoziationskonstanten nicht durch Tangenten bestimmt werden, sondern durch theoretisches Fitting.

„Die Bindungsratio wird durch das Mole Ratio im Mittelpunkt der isothermen Titrationskurve ermittelt.“ Dies bezieht sich darauf, wie viele Bindungsstellen in der Probezelle vorhanden sind, oder? Warum wird die Bindungsratio durch das Mole Ratio im Mittelpunkt bestimmt?

Die Enthalpieänderung war eine Änderung der Y-Achse, aber hier steht „Biding Mechanism“. Warum ist die Enthalpie ein Mechanismus? Und warum fehlt die Entropie!

Hm, keine Ahnung…

Aber die Probenvorbereitung scheint einfacher zu sein, da keine Etikettierung oder Fixierung erforderlich ist. „Wenn ein Ligand an ein Protein bindet, tritt eine Temperaturänderung von millionstel Grad auf,“ was bedeutet, dass dies ein Gerät ist, um solch kleine Temperaturänderungen zu erkennen. Es ist ja auch besser, wenn es keine Veränderungen im Körper gibt, die eine solche Temperaturänderung hervorrufen würden.

In welchen Bereichen ist ITC nützlich…

„ITC wird in der Arzneimittelentwicklung und der Entwicklung von Therapeutika für folgende Zwecke häufig eingesetzt.“…

„Quantifizierung der Bindungsaffinität“ – also ein Parameter, der wie bei ELISA, RI, SPR bestimmt wird. Ohne Fixierung oder Etikettierung und ohne waschen zu müssen, erhält man natürlichere Reaktionsbedingungen, was ein Vorteil ist, denke ich.

„Auswahl und Optimierung von Kandidatentherapeutika“ – Wird die Bindungsstärke gescreent?

„Messung der Thermodynamik und aktiven Konzentration“ – Thermodynamische Parameter sind nützlich bei der Strukturanalyse, aber was bedeutet die Messung der aktiven Konzentration? Meinen Sie die Qualitätskontrolle von Proteinen, die in den Unterlagen von Interphex erwähnt wird?

„Charakterisierung der Mechanismen von Wirkweisen“ – Ich bin mir nicht sicher, was das bedeutet. Meint man den Mechanismus der Bindung?

„Bestätigung von Bindungstargets bei der Entwicklung von niedermolekularen Medikamenten“ – Screening, aber scheint nicht sehr High-Throughput zu sein…

„Erfassung der Bindungsspezifität und Bindungsratios“ – Wie unterscheidet man unspezifische Bindung?

„Validierung der IC50 und EC50 von Hit zu Lead“ – Bezieht sich auf die Optimierung nach dem Screening?

„Messung der Enzymaktivitätsrate“ – Enzyme!? Kann man das wirklich messen?

Oder können Sie tatsächlich nicht herausfinden, wie das eigentlich gemessen wird? Kann man die Handbücher herunterladen?

Zunächst werde ich den Hersteller kontaktieren.“

So kam es, dass Herr Nakamura von Mikrokalorimetrie fasziniert war.

Er scheint eifrig, es auf eigene Faust zu entdecken, aber es gibt immer wieder Dinge, die nicht mit den Informationen aus der Website oder von Handbüchern gelöst werden können.

Wir werden Ihnen fast jeden Monat von Herrn Nakamura’s Reise zum Kalorimetermeister berichten.

Das Ziel ist es, dass Anfänger und Fortgeschrittene in der Kalorimetrie durch nützliche Q&A-Beispiele und Problemlösungen profitieren.

Freuen Sie sich darauf!!

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Anwendungsnotizen zur ITC

Anwendungsnotizen zur DSC

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