Método de la barrera de difusión – los detalles prácticos

¿Cómo realizar la medición del potencial zeta con el método de la barrera de difusión?

El método de la barrera de difusión es particularmente adecuado para volúmenes de muestra bajos y tampones de alta fuerza iónica. El método consiste en inyectar cuidadosamente un «tapón» de la muestra en una celda capilar plegada que ya solo contiene el tampón. (El tampón debe ser el mismo de la preparación de la proteína, con la misma conductividad, mismo pH, mismos aditivos, para igualar la muestra y la barrera de difusión lo más posible). En este esquema, el potencial zeta es principalmente de interés, sin embargo, también se puede determinar el tamaño.

Los detalles prácticos se discuten en «La técnica de la barrera de difusión, aspectos prácticos e interpretación de datos», la presentación web grabada «Mediciones de potencial zeta en proteínas utilizando el nuevo método de barrera de difusión de Malvern» así como la nota de aplicación «La técnica de barrera de difusión para una medición precisa y reproducible de la movilidad de proteínas».  A continuación, se presenta un breve resumen de la visión práctica de los componentes clave de este método.

¿Por qué considerar este método de barrera de difusión?

Hay dos razones principales por las que podrías querer considerar este método. Ambas se deben a la muestra.

1. Baja disponibilidad de la muestra. Si solo tienes una cantidad muy limitada de muestra, entonces este método permite realizar una medición aunque solo parte de la celda contenga muestra.  (Y el resto de la celda contiene tampón).
2. Proteger la muestra de las interacciones con el electrodo. En algunas condiciones (por ejemplo, alta fuerza iónica, algunas sales de fosfato, componentes del tampón que contienen azufre) puede ocurrir ennegrecimiento (degradación) del electrodo. Aunque el ennegrecimiento en sí mismo no es necesariamente malo, es una indicación de posibles interacciones muestra-electrodo.

Otros efectos son el calentamiento Joule, la degradación de la muestra (agregación) y la polarización del electrodo. El uso del método de la barrera de difusión puede ayudar a minimizar estos efectos adversos.

¿Cómo introducir la muestra?

La muestra se inyecta suavemente en la celda capilar DTS1070 llena de tampón con una punta de carga de gel. Hemos probado las puntas de pipeta Costar (1-200µl, redonda, 0.5mm de grosor, Sigma cat:4853) y similares deberían funcionar bien.  Para su uso, empuja suavemente la punta de carga de gel a través de uno de los puertos de carga en la celda capilar hasta que sientas un final “natural” y luego inyecta 70µl al inicio (nunca te equivocarás con la ubicación del tapón en ese caso). A medida que te familiarices más con el método, es fácil reducir el volumen de inyección a 50µl, y eventualment incluso hasta 20µl. Puedes practicar esto con una solución de dextrano azul, o usando el monitor de tasa de conteo en el software (Herramientas – Contador de Tasa) para confirmar que el volumen de dispersión está dentro del tapón de muestra.

¿Qué configuraciones en el software?

Deberías seleccionar configuraciones especiales del instrumento para poder medir el potencial zeta de muestras de proteínas en tampones con fuerzas iónicas relativamente altas. El modo automático del software de análisis zeta reducirá el voltaje aplicado. Pero para el manejo más delicado de la muestra, puedes ajustar manualmente las configuraciones de análisis de acuerdo con la tabla a continuación, tomada de la nota de aplicación.

Para acceder a las configuraciones durante la configuración Manual o SOP ve a:

• Medición -> Duración de la Medición -> Automático -> Número máximo de ciclos
  Deja el mínimo en 10 y selecciona el máximo según la tabla
• Medición -> Medidas -> Retraso entre mediciones (seg)
  Cuando repitas las mediciones, es una buena idea dejar la muestra descansar por 30 segundos
• Medición -> Avanzado -> Voltaje -> Selección Automática de Voltaje -> No
  Introduce el voltaje sugerido según la tabla

Anteriormente

• Obtén el último software Zetasizer DTS (descarga gratuita)
• Titulaciones complejas – dosificación variable (zeta y tamaño)
• Consejos y Trucos para la Caracterización de Nanopartículas (44 preguntas y respuestas)
• Blog de lanzamiento inicial sobre el método de barrera de difusión

Si tienes alguna pregunta, por favor envíame un correo electrónico a ulf.nobbmann@malvernpanalytical.com. ¡Gracias! Las opiniones son generalmente del autor. Nuestro equipo editorial puede haber modificado algunas partes.