Techniques d’évaluation des propriétés physiques dans le développement de produits biopharmaceutiques : Sélection des candidats

Nous vous présentons les éléments à évaluer à chaque étape du développement des produits biopharmaceutiques ainsi que les techniques de mesure proposées par Malvern Panalytical pour réaliser ces évaluations. Cette page offre une présentation détaillée sur la « sélection des candidats ».

Détermination de la taille des particules par distribution de taille et évaluation des agrégats et associations (DLS)

Mesure de la taille de globines

La sélection rapide et aisée des échantillons cibles parmi de nombreux candidats est cruciale. La méthode de diffusion dynamique de la lumière (DLS) permet de déterminer en quelques minutes la taille et l’état de dispersion des particules d’un échantillon, tout en permettant d’identifier rapidement les associations et les agrégats. Le graphique ci-dessous montre la distribution de taille des particules de différentes globines, où l’axe horizontal représente la taille (rayon hydrodynamique) et l’axe vertical la distribution d’intensité lumineuse (Intensité (%)). Le tableau révèle que les valeurs d’intensité de diffusion standard de HbA (bleu) et d’hémocyanine (noir) à 100 % présentent un pic unique. En revanche, les valeurs de Rice Hb1 (vert) et de Polytaur (gris) indiquent une distribution plus large, révélant la coexistence de molécules de grades plus gros.

Avec le DLS, il est possible de déterminer la taille des particules et de visualiser les rapports de surface des pics pour distinguer les ratios de monomères, dimères et oligomères de grade supérieur dans un échantillon. De plus, en utilisant l’information sur la taille des particules fournie par le DLS, il est possible d’estimer la masse moléculaire pour déterminer l’état d’oligomérisation ainsi que le rapport d’agrégats présents dans un échantillon.

Évaluation précise de la masse moléculaire et des informations structurelles à l’aide de plusieurs détecteurs (SEC-LS・Vis)

Évaluation de apo-RD et holo-RD

Les méthodes d’analyse classique basées sur la capacité de rétention utilisent des substances standard, ce qui peut conduire à des conclusions erronées si le volume apparent augmente en raison de changements de structure protéique affectant la masse moléculaire. L’intégration de détecteurs de diffusion de lumière (LS) à la chromatographie sur gel (SEC) est utile pour obtenir une analyse précise via la diffusion laser. Le graphique ci-dessous montre les résultats de la mesure, avec et sans CaCl₂, de la protéine Repeat in Toxin Domain (RD), qui change de structure en présence de Ca²⁺. Comparant les états holo (continu) et apo (dotted), l’émergence plus précoce de apo selon la méthode traditionnelle indique un poids moléculaire erroné de 600 kDa pour apo et 73 kDa pour holo, suggérant un état d’agrégation pour apo. Toutefois, les analyses par diffusion laser indiquent des masses moléculaires similaires de 73 kDa pour les deux. De plus, la viscosité intrinsèque obtenue par le détecteur de viscosité était de 0,35 dL/g pour apo et de 0,055 dL/g pour holo, validant les modifications structurelles induites par la présence d’ions Ca²⁺.

Grâce à la mesure simultanée de multiples détecteurs, une information précise sur la masse moléculaire et la structure permet d’éviter tout mauvais choix lors de la sélection des constructions.

Détermination de la taille des particules et évaluation des agrégats et associations à l’aide de plusieurs détecteurs (SEC-LS・Vis)

Évaluation de la pureté des anticorps

L’éclairement diffus augmente avec la masse moléculaire accrue. En connectant des détecteurs de diffusion laser à la SEC, des zones d’agrégation difficiles à identifier avec RI ou UV/VIS, fréquemment employés, deviennent clairement visibles. Le graphique ci-dessous illustre la mesure d’un IgG avec des détecteurs connectés à SEC: RI et diffusion laser. Les monomères et dimères apparaissent tant dans le signal RI (rouge) que celui de diffusion laser (orange), mais dans la zone d’agrégation, le signal de diffusion laser excède nettement celui de RI (flèche rouge). Comme les signaux du détecteur RI et du détecteur UV/VIS sont affectés par la concentration, la présence d’agrégats en faible quantité peut réduire le signal. L’addition de diffusion laser permet d’essayer de distinguer entre la présence réelle d’agrégats et une fluctuation de la ligne de base.

En utilisant SEC-LS・Vis, il est possible de confirmer plus précisément la pureté d’un échantillon, et ainsi de choisir des constructions aux niveaux de pureté plus élevés, qui sont de préférence sélectionnées.

Sélection des constructions par comparaison de la stabilité thermique (DSC)

Comparaison de la stabilité thermique de 12 anticorps différents après mutation de la région Fab

Il est bien connu que l’insertion de mutations dans les protéines peut modifier leur activité et leur stabilité, et l’amélioration de la stabilité peut avoir un impact sur l’activité. La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) peut évaluer la stabilité thermique des protéines sans étiquetage. Le diagramme ci-dessous montre les données de mesure DSC du type sauvage (WT) et de 12 mutants de la région Fab d’un anticorps reconnaissant la toxine tétanique. L’axe horizontal représente la température, et l’axe vertical la capacité thermique nécessaire à la dénaturation. Comparé à la Fab WT dont le T_m (température de sommet de pic principal) était de 78,7 °C, le mutant V11 montre une stabilité améliorée avec un T_m de 92 °C, soit 13,3 °C de plus.

Avec DSC, vous pouvez comparer comment de petites différences de séquences dans la région variable des anticorps affectent la stabilité thermique, vous permettant de resserrer le choix de candidats de construction plus stables.

Sélection de constructions fondée sur l’activité de liaison (ITC)

Interaction entre trois peptides d’histone différents et une protéine d’histone chaperonne

Dans le développement de médicaments, il est crucial de choisir efficacement les candidats avec la plus grande affinité pour la protéine cible. L’isotherme de titrage calorimétrique (ITC) permet d’évaluer l’affinité d’interaction moléculaire, la spécificité, et le mécanisme de liaison dans une seule mesure.

Le diagramme ci-dessous compare l’interaction de la PHD (plant homodomain) du domaine associé à la TAF3 (TBP-binding protein) chaperonne d’histone contre trois peptides d’histone (10-mères) distincts. La série supérieure montre les données brutes, tandis qu’en bas, les axes horizontal et vertical représentent respectivement le ratio molaire et le changement d’enthalpie de réaction (△H). Ces interactions fournissent une courbe sigmoïdale, typique d’une liaison 1:1, et l’analyse de fitting indique des affinités variables selon le peptide. Les différences d’affinité sont visibles dans la pente des courbes, où la force d’affinité augmente lorsque la pente est plus verticale et diminue si la pente est plus plate.

Avec l’ITC, la sélection de constructions ayant une haute affinité est ainsi renforcée.

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