Techniques d’évaluation des propriétés physiques dans le développement de produits biopharmaceutiques : Investigation de la formulation

Nous présentons les éléments à évaluer à chaque étape du développement de produits biopharmaceutiques et les techniques de mesure de Malvern Panalytical qui permettent leur évaluation. Sur cette page, nous introduisons en détail le thème de l’« Investigation de la formulation ».

Évaluation de la stabilité de dispersion à l’aide du coefficient de diffusion (DLS)

Comparaison du coefficient de diffusion sous différentes conditions de formulation en fonction de la dépendance de la concentration en anticorps

Dans les produits biopharmaceutiques, il est possible d’évaluer la stabilité de dispersion en traçant le coefficient de diffusion mesuré par dispersion de lumière dynamique (DLS) en fonction de la concentration. Le graphique ci-dessous montre les résultats de la mesure du changement de taille des particules en réponse à la variation de concentration pour un anticorps IgG dispersé dans différents tampons à l’aide de DLS.

Dans le tampon 1 (à gauche du graphique), à mesure que la concentration augmente, la taille des particules augmente et le coefficient de diffusion diminue. En revanche, dans le tampon 2 (à droite du graphique), la taille des particules diminue et le coefficient de diffusion augmente. Cela est influencé par l’augmentation apparente du coefficient de diffusion dans le tampon 2 due aux forces répulsives des interactions intermoléculaires. Le graphique ci-dessous trace le coefficient de diffusion en fonction de la concentration, et lorsque la pente de la ligne droite est négative (bleu), la stabilité de dispersion est faible, et si la pente est positive (rouge), la stabilité de dispersion est élevée et il y a peu d’agrégats.

Ainsi, avec l’utilisation de DLS, il est possible d’évaluer la stabilité de dispersion d’un échantillon sous différentes conditions de formulation.

Évaluation de la stabilité de dispersion à l’aide du deuxième coefficient viriel (SLS)

Comparaison du deuxième coefficient viriel dans différentes conditions de formulation en fonction de la dépendance à la concentration de l’échantillon

La dispersion stable obtenue par une méthode de dispersion de lumière statique (SLS), qui est une forme de dispersion de lumière, permet de calculer la masse moléculaire de l’échantillon ainsi que le deuxième coefficient viriel (B22), ce qui permet de suggérer la stabilité de dispersion. Le diagramme supérieur montre l’évaluation de la stabilité de dispersion de la lysozyme dans un tampon contenant différentes concentrations de NaCl par SLS. Pour chaque concentration de NaCl, la concentration protéique est modifiée pour tracer KC/Rθ (traçage Debye) et B22 est obtenu à partir de l’inclinaison. Ce paramètre représente la relation entre le soluté et le solvant, et généralement, si B22 est positif, il suggère que la protéine est stable en dispersion. De cette façon, il a été démontré que la lysozyme a une stabilité élevée en dispersion dans les conditions de tampon avec 0 % de NaCl.

Le diagramme inférieur compare le B22 lorsque le même anticorps est placé dans différents tampons. À partir de ce résultat, il est démontré que la stabilité de dispersion est élevée dans le tampon 2.

Ainsi, l’utilisation de SLS permet l’évaluation des protéines en tenant compte de la stabilité de dispersion dans diverses conditions de formulation.

Évaluation de la stabilité de dispersion par la diffusion de lumière électrophorétique (ELS)

Comparaison du potentiel zêta de l’anticorps sous différentes conditions de formulation

Le potentiel zêta, en tant qu’indicateur de la dispersion, est déterminé à l’aide de la diffusion de lumière électrophorétique (ELS), une méthode de diffusion de lumière, et dépend de la molécule et de son environnement (type de tampon). Le graphique ci-dessous montre les résultats de la comparaison du potentiel zêta de l’IgG dans différents tampons. Dans ELS, comme la concentration en sel est généralement établie à un niveau élevé, les mesures peuvent devenir instables. Par conséquent, plusieurs mesures sont effectuées pour vérifier la reproductibilité. Dans le tampon 1 (bleu), le potentiel zêta est faible, et la charge calculée à partir de la mobilité électrophorétique (données non affichées) est également faible (0,8), indiquant une faiblesse dans la stabilité de la dispersion et suggérant une interaction dipolaire. En revanche, dans le tampon 2 (rouge), un potentiel zêta et une charge élevés (6,5) indiquent une stabilité électrostatique élevée.

Ainsi, l’utilisation d’ELS permet d’évaluer les différences de stabilité de dispersion dues aux interactions de surface des molécules sous différentes conditions de formulation.

T_m et évaluation de la stabilité thermique en utilisant T_agg comme indicateur (DLS)

Comparaison de la stabilité thermique de Recombumine dans 10 conditions de formulation différentes

Dans le développement des ingrédients pharmaceutiques actifs (API), il est important de concevoir des formulations qui garantissent une stabilité suffisante pour un stockage à long terme, avec des conditions de manipulation recommandées.

Dans le DLS, la température à laquelle l’agrégation commence (T_agg) est obtenue à partir du changement de taille des particules sous conditions de chauffage, permettant l’évaluation de la stabilité thermique dans diverses conditions de solvant. Les conditions de stabilité thermique élevée sont considérées comme étant similaires même en stockage prolongé. Le graphique ci-dessous montre le résultat d’une mesure à haute température de la Recombumine dispersée dans un tampon ajusté à divers pH, effectuée par DLS. La plupart des échantillons formulés entre pH 3 et 10 ont montré des T_m similaires (67-68 °C). Les deux échantillons formulés à pH 6 (cadre rouge) ont montré la plus grande stabilité thermique, ne commençant pas l’agrégation jusqu’à ce que le T_m dépasse 74 °C. En revanche, deux échantillons formulés à pH 3 (vert) et 4 (jaune) montrent des tailles de particules élevées dès le début de la montée en température, suggérant une état déjà dénaturé.

Ainsi, avec la mesure à haute température du DLS, il est possible d’évaluer la stabilité thermique sous différentes conditions de formulation.

T_m et évaluation de la stabilité thermique en utilisant T_1/2 comme indicateur (DSC)

Comparaison de la stabilité thermique des anticorps sous 19 conditions de formulation différentes

Les conditions de formulation des produits biopharmaceutiques (type de tampon, pH, additifs) peuvent être restreintes en comparant la stabilité thermique des échantillons dans diverses solutions à l’aide du calorimètre à balayage différentiel (DSC). Les données du haut comparent les données DSC pour le même anticorps sous trois conditions de solutions de pH différent. À pH 3.5, la position du pic principal est déplacée vers des températures plus basses que celles de pH 5.5 et 6.2, et la température de début de dénaturation est également plus basse, indiquant une condition de faible stabilité thermique. Le graphique central montre la comparaison des températures de dénaturation du pic principal (T_m) d’un anticorps mesuré en DSC sous 19 conditions avec différents tampons et pH. Les 12 conditions, de l’acétate 5.0 au Tris 7.5, montrent des T_m presque équivalentes (flèche rouge centrale) et ont été considérées comme des candidates pour les conditions de formulation. Habituellement, cette méthode restreint les conditions de formulation, mais en plus, le graphique du bas compare, dans les mêmes conditions que le graphique central, l’anticorps immédiatement après ajustement (bleu) et après une semaine (jaune) à l’aide de la largeur de la température à moitié hauteur du pic principal (T_1/2). Plus la largeur en température de T_1/2 est étroite, plus la structure est compacte et stable, amenant à des conditions encore plus restreintes (flèche rouge inférieure) par rapport à la simple comparaison de T_m.

Ainsi, en comparant la stabilité thermique dans différentes conditions de tampon à l’aide de multiples paramètres obtenus en DSC, il est possible de déterminer les conditions de formulation optimales.

Quantification des agrégats de protéines par la lumière diffusée (NTA)

Dans le développement de médicaments, il est important de détecter et de quantifier les SVP (Sub Visible Particles).

L’analyse de suivi de nanoparticules (NTA) expose les particules en suspension liquide à un faisceau laser, et détecte la lumière diffusée par caméra, permettant de détecter des particules de dimensions submicroniques et de taille nanométrique invisibles à un microscope optique, à partir de 10 nm*. En suivant le mouvement brownien des particules en suspension à l’aide d’une analyse d’image, il est possible de calculer simultanément leur diamètre. Les agrégats de protéines supérieurs à 50 nm peuvent être détectés, comblant ainsi le fossé entre l’analyse au microscope ou au cytomètre de flux et celle par chromatographie.

Le graphique ci-dessous détecte les agrégats de protéines dans le tampon qui ont été concentrés au niveau permettant leur détection par lumière diffusée. L’axe horizontal représente la taille et l’axe vertical le nombre de particules.

Ainsi, l’analyse NTA permet de visualiser des agrégats difficiles à détecter par les méthodes traditionnelles, permettant d’appuyer la décision concernant les meilleures conditions de formulation. *Dépend du matériau et de la densité de la particule

Évaluation quantitative des SVP par lumière diffusée sous différentes conditions de formulation (NTA)

Détection des SVP dans l’insuline avec l’ajout de quatre antioxydants différents

Le NTA permet de calculer la concentration en particules SVP car la zone de mesure est connue. Le graphique ci-dessous est le résultat de l’analyse des SVP pour des échantillons d’insuline à 1 mg/mL avec divers antioxydants à 100 μM ajoutés, conservés à 4 °C pendant 72 heures. L’axe horizontal indique la taille, tandis que l’axe vertical représente le nombre de particules. L’insuline en PBS sans antioxydant (A) montre une faible concentration en SVP détectée. Selon l’antioxydant ajouté, certains entraînent la formation de nombreux agrégats (B, D, E), alors que d’autres n’en entraînent pas (C).

Ainsi, l’utilisation du NTA permet une évaluation quantitative de la teneur en SVP sous différentes conditions de formulation, appuyant la détermination des meilleures conditions de formulation.

Évaluation de la stabilité thermique par le changement de distribution de taille des particules (DLS)

Comparaison des changements de taille lors du test accéléré avec ConA en présence de quatre sucres différents

DLS permet l’évaluation de la stabilité thermique des produits protéiques lorsque des additifs sont ajoutés.

Le graphique ci-dessous montre les résultats du changement thermique mesuré par DLS après ajout de divers sucres (10 mM) à 1 mg/mL de Concanavaline A (Con A), pour évaluer comment la liaison avec ces sucres modifie la stabilité thermique. L’axe horizontal indique la taille, et l’axe vertical représente la distribution d’intensité lumineuse (Intensity(%)). L’état à 35 ℃ (en haut) montre un état monodispersé propre, avec une position des pics qui se chevauche également. En revanche, l’état à 47 ℃ (en bas) montre les différences dans l’état des agrégats (taille, quantité) selon le type de sucre ajouté.

À propos de l’état autour du pic principal vers 10 nm, l’absence de sucre (violet clair) et le lactose (vert) voient un décalage important de la taille des particules, montrant une agrégation, tandis que le glucose (bleu), le fructose (noir), et le mannose (rouge) se lient à Con A et améliorent la stabilité thermique.

Ainsi, avec le DLS, il est possible d’évaluer l’impact de différents additifs sur la stabilité thermique par changement de taille, soutenant ainsi la détermination des meilleures conditions de formulation.

Évaluation de la stabilité par le changement de taille (SEC-LS)

Confirmation de l’abaissement, agrégation et fragmentation des anticorps après test accéléré

La chromatographie par exclusion de taille (SEC) est souvent utilisée pour évaluer la stabilité des formulations protéinique après un test accéléré.

Le graphique ci-dessous montre les résultats de la mesure par SEC sur un échantillon d’anticorps IgG après exposition à une chaleur déterminée dans un bain-marie. En comparant les résultats avant ajustement (rouge) et après maintien à 60 °C pendant 135 minutes (violet), un rapport plus élevé de monomères et plus faible de dimères a été confirmé pour le second. Dans un échantillon maintenu 60 heures à 60 °C (vert), l’agrégation augmente, avec de plus grands agrégats confirmés (flèche rouge: autour de RV 6 mL). Un pic est également apparu à l’arrière du pic principal des monomères (flèche jaune : autour de RV 10 mL), indiquant une fragmentation.

Ainsi, l’utilisation de SEC permet d’évaluer l’agrégation et la fragmentation dues à la stabilité lors des tests accélérés, soutenant la détermination des meilleures conditions de formulation.

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