Techniques d’évaluation des propriétés dans le développement biopharmaceutique : Contrôle de la qualité

Nous vous présentons les éléments à évaluer à chaque étape du développement de biopharmaceutiques et les techniques de mesure de Malvern Panalytical permettant de réaliser ces évaluations. Cette page se concentre en détail sur le contrôle de la qualité.

Évaluation de la taille multiparamétrique avec plusieurs détecteurs (SEC-LS・Vis)

Évaluation de la masse moléculaire absolue et de la viscosité intrinsèque de la β-amylase

La combinaison de la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec un détecteur de diffusion de la lumière (LS) permet de déterminer la masse moléculaire absolue. Cette masse moléculaire absolue est corrélée au poids moléculaire, les molécules plus lourdes diffusant plus de lumière que les molécules plus légères. L’image ci-dessous montre les résultats de mesure SEC-LS de l’β-amylase. Selon la courbe d’étalonnage, les deux pics observés sont interprétés comme un agrégat au début et un monomère ensuite. Cependant, en réalisant une analyse de masse moléculaire absolue à l’aide d’un détecteur de diffusion de la lumière, on constate que la masse moléculaire des deux pics est presque identique comme illustré dans le tableau, mais que la viscosité intrinsèque diffère, ce qui suggère une différence dans la structure moléculaire. Cela implique que ces deux pics consistent de molécules de volumes différents.

En utilisant une évaluation multiparamétrique SEC, une comparaison détaillée et précise des tailles des protéines formulées est possible.

T_m et prédiction d’instabilité par T_1/2 comme indicateur (DSC)

Impact de l’oxydation forcée sur la stabilité thermique des anticorps

La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) permet d’examiner les effets de l’oxydation, potentiellement survenus lors du stockage ou du transport, en comparant la stabilité thermique. L’image ci-dessous montre les résultats de mesure DSC avant et après oxydation forcée des anticorps. On constate que la température de début de dénaturation (T_onset) du T_m1 initial baisse après oxydation, avec un pic plus large. En revanche, le T_m2 du pic principal est peu affecté, suggérant une instabilité du domaine Fc-CH2 induite par l’oxydation.

La DSC permet d’évaluer quel domaine est affecté par l’oxydation dans les anticorps thérapeutiques.

Confirmation de l’activité de liaison par changement d’enthalpie comme indicateur (DSC)

Corrélation entre stabilité thermique de gp120 et activité de liaison avec CD4

Les données obtenues par DSC indiquent que si la structure secondaire du matériau est préservée, les pics coïncident complètement sous conditions de concentration et de tampon identiques. L’image ci-dessous (a) montre les données DSC entre différents lots de protéines gp120. Bien que les sommets de pic soient autour de 61 ℃, les tailles des pics diffèrent. Pour l’image (b), les changements d’enthalpie obtenus (équivalents à la surface sous les pics) sont présentés en abscisse et l’activité de liaison (%) de CD4 à gp120 en ordonnée, montrant une corrélation linéaire. Une enthalpie moindre suggère une présence de lots contenant des molécules inactives.

La DSC permet une évaluation de la qualité post-fabrication.

Évaluation de l’équivalence par similarité de formes de pics (DSC)

Évaluation de l’équivalence entre lots d’anticorps

Les thermogrammes obtenus par DSC, si la structure secondaire du matériau est préservée, produiront des formes identiques (empreintes digitales) sous conditions de concentration et de tampon identiques. Si les formes diffèrent, cela suggère la présence d’une structure partiellement instable. De plus, même des formes similaires, si la surface de pic diminue, suggèrent une dénaturation présente dans la solution.

L’image ci-dessous évalue l’équivalence entre lots d’anticorps formulés. L’accord des thermogrammes indique une équivalence entre lots.

La DSC permet une évaluation de l’équivalence des formulations protéiques entre lots et sites.

Évaluation de l’équivalence par affinité et rapport de liaison (ITC)

Évaluation de l’activité de liaison de protéines de lots différents

Le rapport de liaison obtenu par calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est déterminé par l’axe horizontal des données, représentant le ratio « concentration échantillon de seringue/concentration échantillon de cellule ». En général, la cellule contient des protéines, ce qui permet une évaluation de l’activité de liaison en comparant ce rapport. L’image ci-dessous compare l’activité de liaison entre différents lots d’une protéine par ITC. Un peptide utilisé comme positif est dans la seringue. Les courbes sigmoïdes obtenues sont de pente similaire, avec une affinité de 97.1 nM pour le lot 1 et 135 nM pour le lot 2, montrant peu de différence. Cependant, le rapport de liaison est de 1.05 sites pour le lot 1 et 0.235 sites pour le lot 2. Une activité de liaison maintenue donnerait théoriquement un rapport de 1, révélant que seulement 24% de l’activité est conservée pour le lot 2.

Grâce à l’ITC, il est possible d’évaluer si l’activité de liaison des formulations protéiques est préservée entre lots et sites.

Évaluation de taille et de distribution de taille par diamètre de particule et PdI (DLS)

Comparaison de la stabilité colloïdale des anticorps sous différentes conditions de stockage

Les conditions de stockage des anticorps influent considérablement sur leur qualité. La mesure du diamètre de particule par diffusion dynamique de la lumière (DLS) permet d’évaluer l’optimité des conditions d’utilisation.

L’image ci-dessous montre les résultats de mesure de taille de particule pour l’IgG sous différentes conditions de stockage. À 4 ℃ pendant 35 jours (vert), l’absence d’agrégats et le faible PdI (indice de polydispersité) sont confirmés. En revanche, cinq cycles de congélation/décongélation (rouge) présentent des agrégats, avec un PdI très élevé. Les échantillons conservés à 25 ℃ pendant 31 jours (bleu) montrent peu d’agrégats, mais un PdI légèrement élevé. Pour un examen détaillé des conditions de stockage, l’évaluation par taille de particule et PdI est utile.

Avec le DLS, la formulation protéique peut être évaluée en taille et distribution de taille de particule sous différentes conditions de stockage au fil du temps, permettant une optimisation des conditions de conservation.

Évaluation temporelle SVP par diffusion de lumière (NTA)

Observation temporelle SVP d’anticorps sous conditions extrêmes

Les essais de stabilité accélérée sont requis en gestion de qualité pour évaluer les médicaments. En plus de la taille de particule, ajouter le paramètre de concentration de particules par analyse de suivi de nanoparticules (NTA) permet une évaluation plus détaillée. L’image montre une évaluation NTA d’anticorps IgG sous conditions plus sévères que celles normales. Lorsqu’IgG, ajusté à 1 mg/mL, est chauffé à 50 ℃, l’analyse montre que la concentration et la taille des agrégats augmentent tangiblement au fil du temps.

Avec NTA, l’évaluation quantitative de SVP est possible.

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