Le chemin vers le maître calorimètre Vol.10 Dernière session: Divers sur le calorimètre Entretien professionnel

par Malvern Panalytical, Thursday, 17th November 2016

Cette fois, nous avons invité le professeur Fukada de l’Université Préfectorale d’Osaka et le professeur Lee de l’Institut de recherche sur les protéines de l’Université d’Osaka pour discuter des divers aspects du calorimètre. Nous avons discuté de ce qui les a poussés à effectuer des mesures avec un calorimètre, de leur recherche actuelle, et des questions fréquentes des utilisateurs.
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1. Comment avez-vous commencé à faire des mesures thermiques ?

J’ai une expérience d’environ 13 ans en calorimétrie et j’ai commencé par me former en autodidacte avec l’ITC. J’ai été motivé par des recherches utilisant la spectroscopie RMN en solution. En examinant la liaison d’une enzyme et de son partenaire par RMN, j’ai découvert une augmentation du flottement de l’enzyme au niveau des résidus d’acides aminés. Normalement, on pense que la structure des protéines se rigidifie à la liaison, mais il y avait des fluctuations. Cela m’a conduit à l’idée que la liaison augmentait l’entropie conformationnelle stabilisant le complexe via l’ITC. Et j’ai débuté les mesures en suivant le manuel. En effectuant des mesures à différentes températures, on obtient des valeurs comme ΔH et ΔCp permettant d’identifier les changements d’enthalpie et d’entropie du système. Cela a finalement corroboré nos résultats RMN.
J’ai commencé les mesures thermiques lors de ma thèse. Mon directeur était le professeur Katatada Takahashi, pionnier en calorimétrie biochimique au Japon. J’ai continué depuis dans cette voie. Quand le professeur Lee a annoncé ses résultats montrant un flottement à la liaison, ce fut initialement mal accueilli. Dans le passé, il y avait une résistance à l’idée que l’entropie à la liaison puisse être positive si l’on ignorait les effets conformationnels et d’hydratation.
La discussion autour de la déshydratation ou du repliement protéique a émergé à cette époque. L’étude des changements d’enthalpie dans la déprotonation a marqué ma carrière.
En tant qu’agronome, j’étais critiqué pour explorer ce domaine. Pourtant, grâce à l’appui de mon directeur favorable à ces études, j’ai pu mener à bien mes travaux.
Je crois qu’on devrait creuser davantage la recherche fondamentale dans ces domaines.
Les études dites fondamentales en solutions tampons ne sont pas vraiment utilisées par les chimistes, bien que leur valeur pratique reste indéniable.

2. Parlez-nous de vos recherches récentes.

　

Je m’intéresse actuellement à l’agrégation des protéines, un processus impliqué dans de nombreuses maladies dites « protein misfolding diseases ». Des maladies comme Alzheimer, Parkinson, le diabète de type II ou la maladie à prions sont typiques. À mes débuts, cette catégorie comptait une vingtaine de pathologies, un chiffre aujourd’hui doublé. L’agrégation est un phénomène impossible à ignorer. Mon projet, basé sur la recherche sur l’insuline, vise à obtenir une description thermodynamique complète en utilisant l’ITC et le DSC pour analyser les états de la protéine.
Bravo ! L’insuline est un échantillon nostalgique pour moi, mon premier en laboratoire. Mes expériences incluaient la détection des modifications thermiques lors de la réduction des liaisons disulfure. À défaut d’un calorimètre moderne à l’époque, nous utilisions un simple flacon Dewar et un thermistor.
Quelle quantité ! Mesures coûteuses, surtout sans système d’expression cellulaire.

3. Le développement de l’ITC du point de vue utilisateur

J’ai surtout utilisé le VP-ITC dans mes travaux mais, par manque de matériel, j’ai emprunté un iTC200 à l’Université de Kyoto et apprécié la réduction du volume d’échantillon. Je teste aujourd’hui le PEAQ-ITC. Moins d’échantillons requis, économie de temps et températures stabilisées rapidement : des améliorations notables. La capacité de mesurer rapidement des titrations importantes, suivi de nettoyage automatique, sont des atouts. Le PEAQ-ITC détecte et corrige les dysfonctionnements, un progrès indéniable comparé aux nettoyages manuels rigoureux du VP-ITC.
 

4. Le développement du DSC du point de vue utilisateur

　

Le DSC a peu évolué comparé à l’ITC. Le VP-DSC, très sensible, permet des mesures à des concentrations dix fois plus basses que celles autrefois requises (0,1 mg/mL contre 10 mg/mL récemment). Développé en 1996, le VP-DSC marqua la transition aux cellules capillaires au XXIe siècle. De nouveaux utilisateurs peuvent s’initier à cette technologie grâce aux améliorations sensibles de produits commercialisés.
Les travaux de Privalov (Johns Hopkins Univ.) ont été la genèse de cette avancée en calorimétrie.” MicroCal DSC a débuté en 1977 et s’est popularisé après l’introduction du VP-DSC.
 
 Les capacités de mesure n’étaient pas aussi avancées lors de mes débuts ; pourtant, la volonté de comprendre comment les protéines réagissent à la température reste une constante fascinante. La démocratisation de ces outils a eu le mérite d’intensifier les investigations dans ce domaine.

5. La calorimétrie a-t-elle encore un seuil d’entrée élevé ? Quelle est la valeur de ΔCp ?

　　 　　 　　 　　

L’arrivée d’équipements de calorimétrie sur le marché a augmenté l’accessibilité aux mesures, mais peu osent s’y aventurer. Avoir des bases solides sur les macromolécules biologiques serait utile. Un manuel sur la stabilité structurelle des protéines a été écrit il y a 15 ans (voir référence 3). Cependant, la recherche sur la stabilité thermique des protéines semble en recul face à des études sur les maladies liées à une mauvaise transformation des protéines.
ΔCp reste un bon caractéristique pour différencier les protéines, liée à la nature des résidus hydrophobes internes d’une protéine repliée. Les valeurs de ΔCp diffèrent entre protéines globulaires et désordonnées en fonction de leur conformation, telle que démontrée par des études sur l’α-synucléine, une protéine désordonnée associée à la maladie de Parkinson. Comprendre et caractériser ces tendances pourrait clarifier les comportements thermiques distincts des protéines désordonnées.
Extraire des valeurs physiques précises pour une protéine reste complexe, d’où l’importance, par exemple, d’une concentration exacte de l’échantillon. La chaleur absorbée et qui se dissipe lors de dépliement ou interaction protéine-solvant reste quantitativement délicate.
Pour ΔCp, une analyse de base suffit par ajustement dans certains cas, mais la répétition et l’analyse à température variable permettent de tirer des conclusions fermes, même si les changements structurels au cours des phases thermiques complexes sont souvent simplifiés. La recherche continue pourrait viser à clarifier ces données confusantes, entre état naturel et dénaturé, tel que Privalov l’a expérimenté sur la température.
 
Les incertitudes sont présentes, mais l’apparition de ces tendances, même avec des approximations, reste un tremplin.

6. Expliquez simplement les paramètres obtenus via le calorimètre !

　 　　

Cp mesure la capacité calorifique, soit la chaleur nécessaire pour élever de 1°C la température de l’objet sous pression constante ΔCp. Traduit, ce serait comme une patience thermique. Lors de mes cours de physico-chimie, j’associe les paramètres thermodynamiques à des concepts humains : G relie les aspirations, S l’envie de liberté, et H l’énergie endurée, des analogies souvent bien reçues par les étudiants et illustrant ainsi des aspects intermoléculaires liés aux affinités.
Un compliment peut-être ambigu ? (rire)
 
Physico-chimiques et thermodynamiques concepts semblent intimidants. J’essaie de rendre la compréhension facile, prudemment et pédagogiquement, dans un contexte interactif avec les élèves.
Dans ITC, l’affinité issue des mesures est simple, mais l’interprétation ultime de ΔH et ΔS peut être ardue. ΔH reflète souvent les liaisons hydrogène et S une liberté accrue. Comme une interaction que j’explique à mes étudiants quand on lie quelqu’un, échauffement rendu par H, et S diminue freins relationnels, un exemple instructif pour différencier les diverses forces intermoléculaires.
Oui, mais tant d’autres facteurs obscurcissent souvent H et S, les constats ne sont parfois qu’indicatifs. Cependant, détailler chaque réactivité moléculaire nécessiterait sûrement un survol initial simple, tel l’appréciation de KD, des ratios de liaison et parallèles thermodynamiques.

7. En quoi consiste l’obtention de données fiables ?

　 　　

Les données afférentes à un échantillon correctement préparé sont fiables. Affiché un jour, un chiffre devient une assertion tangible, d’où l’importance de la rigueur dans la génération de valeurs répétées et la validation expérimentale.
C’est exact. L’importance du matériel se manifeste dans l’observation répétée et sa conformité. Y compris la comparaison de résultats de liaisons et méthodes cumulatifs comme ITC, où tout lien entre résultats, analyse structurelle et interaction moléculaire a son sens.
Prudence et propreté avant chaque mesure sont cruciales. J’use de savon dans toutes mes préparations post-mesures, et vérifie que le bruit de fond n’évoque aucune salissure interne.
Effectivement, mes étudiants savent l’importance des entretiens pré et post-mesures quant à la qualité d’observation. Noter les variations des mesures, y compris des facteurs conditionnels et la performance interne constante du matériel, est crucial pour assurer une validité.

8. Recommandez-vous des références pour interpréter les données ?

Les pionniers de la calorimétrie : Sturtevant, Privalov, Cooper, Freire, Ladbury, ont produit des lectures précieuses. Sturtevant est un classique (réf. 4). Ses travaux sur l’entropie et la capacité calorifique inspirent toujours les chercheurs expérimentés, préférables aux novices aux bases étendues de calorimétrie théorique.
Parfait pour des études interprétatives. Je conseillerais également mes références récapitulées lors de mon webinaire pour Malvern en juin 2016.
Le Nature Protocols contient certaines contributions récentes sur ITC (réf. 5, 6), transparentes dans methodologies, notamment à la disposition de l’analyse, de la préparation et des exemples d’application coïncident avec Freire et le livre Biocalorimetry 2 de Ladbury. Sortir une troisième édition pourrait enrichir les praticiens.
 
 Simplifier l’apprentissage par la création d’un manuel didactique adapté aux débutants serait crucial. Mon article de synthèse reliant résultats ITC aux concepts et à l’entropy conformationnelle pourra peut-être également servir de guide. Les articles « maîtriser le calorimètre » de Malvern sont de précieux outils.

9. Quels types de mesure souhaiteriez-vous réaliser à l’avenir ?

Exploiter ITC offre de nombreuses perspectives. Je suis venu à envisager son suivi pour le folding des protéines en ajustant les conditions de solvant, telle que la neutralisation du pH, constituant une part de ma démarche, voire une enzyme qui agit comme déclencheur. En contrepartie des mesures typiques avec le DSC, la stimulation par ITC permettrait un monitorage du folding. Beaucoup d’aspects de folding complexes me sollicitent encore. La série de webinaires Malvern m’autorisera peut-être à parler de nos avancées sur l’immersion calorimétrique pour le diagnostic et l’inhibition des agrégations pathogènes.
Un sujet fort intrigant.
Récemment, j’ai testé E. coli au DSC pour explorer la toxicité membranaire induite par peptides.
Il y a plus de dix ans, j’avais observé des chocs thermiques notables sur la levure.
Passionnant, professeur Fukada ! J’ai aussi noté le potentiel d’ITC à quantifier l’énergie de processus enzymatique à la Michaelis-Menten. Diverses approches thermodynamiques émergent avec une fine résolution des concepts Kon et Koff, résultat de la progression technique contemporaine.
Dire que la vitesse de réaction observée avec ITC ou DSC enrichit notre compréhension, bien que nous efforçons d’estimer ces mouvements thermiques récents ! Leur ponctualité sur l’échelle de secondes reste cruciale pour les profilages énergétiques sous ITC.
Les notes d’application pertinentes peuvent être téléchargées ici.
Mesure enzymatique

Constante de vitesse de réaction

L’Espagne s’intéresse traditionnellement à la cinétique. Le DSC avait été autrefois utilisé pour ces analyses. Les conclusions critiques émergent parfois, pourtant, resterait une piste via l’ITC suivant la maquette adéquate.
Bien que distinct de l’ITC, le DSC permet des analyses cinétiques. Après la décongélation thermique incorpore des modèles comme Lumry-Eyring. Cette voie reste peu explorée alors qu’elle nous fascine toujours, nous poussant à modéliser d’autres réactions.
Quant aux constantes de vitesse, quelles sont les limites inférieures observables via l’ITC ?
Les réactivités en-dessous de l’ordre de la seconde sont difficiles à détecter avec ITC, notamment pour des processus comme la liaison rapide parfois sous-pondérée, mais le spectre ITC s’élargit progressivement vers des transitions plus complexes.
Les échanges relatifs à des configurations conformationnelles sont prometteurs, ouvrant des opportunités d’analyse à la marge des processus rapides révélés par pathologie thermique.
 

【Commentaire de la discussion】

Après un an et demi d’exploration sur le chemin du maître calorimètre, ce dixième volume se conclut par ce dialogue enrichissant entre le Professeur Fukada de l’Université Préfectorale d’Osaka et le Professeur Lee de l’Institut de Recherche en Protéines de l’Université d’Osaka. Espérons que notre présentation a facilité votre approche des calorimètres. Durant cet entretien, nos experts ont partagé des interprétations concrètes additionnant celles des manuels, une contribution à une meilleure compréhension. Malvern reste engagé à fournir des technologies et des informations utiles à vos recherches. Un remerciement spécial aux Professeurs Fukada pour sa supervision du blog, et Lee pour son engagement lors des webinaires.
Liste des références citées disponible ci-après en téléchargement en cliquant sur le bouton ci-dessous.

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