MicroCal PEAQ-ITC と有機溶媒：ヒントと注意点

著者 Verna Frasca, Tuesday, 23rd June 2020

概要

アイソサーマル滴定カロリメトリー(ITC)の応用において、結合パートナーを有機溶媒で溶解することへの関心が高まっています。これらには、ゲスト: ホストの化学反応、ナノ粒子、不溶性材料が含まれます。成功するためには、有機溶媒を使用した実験プロトコルを、通常の水性バッファーを用いる方法から若干修正する必要があります。このブログには、MicroCal PEAQ-ITC システムで有機溶媒を用いた実験を成功させるためのヒントが掲載されています。

他のMicroCal ITCを使用している場合や追加の質問がある場合は、地域のMalvern Panalyticalオフィスまたはヘルプデスクに連絡してください。

MicroCal PEAQ-ITCまたは他のMicroCal ITCシステムで有機溶媒を使用する前に、実験を行う前にこれらの注意事項を確認してください:

  • Malvern Panalyticalは、すべての有機溶媒とすべての機器コンポーネントをテストしていません。MicroCal PEAQ-ITCユーザーガイドまたは地域のMalvern Panalyticalオフィスから、湿潤表面のコンポーネントの完全なリストを入手できます（一部のリストは以下に示します）。MicroCal VP-ITCとiTC200は、一部異なる材料を使用しています。
  • 特定の機器コンポーネントと関心のある溶媒についての情報を得るため、化学耐性ガイドを確認してください。オンラインで利用可能なガイドがいくつかあります。
  • PEAQ-ITCを有機溶媒にさらす時間を制限し、使用後は有機溶媒を完全に除去してください。有機溶媒をITCセルやシリンジに保持しないでください。万が一こぼした場合は直ちに清掃してください。
  • 溶媒からの揮発性ガスが機器の電子機器部分に浸入し、セルコアを損傷することがあります。これは高額な修理となる可能性があります。
  • ソルベントがすべての機器コンポーネントと互換性があることが分かっている場合を除き、PEAQ-ITC洗浄モジュールや自動化PEAQ-ITCのオートサンプラーで有機溶媒を使用しないでください。
  • 有機溶媒の人体や環境へのリスク、および予防策を知ってください。有機溶媒を適切に換気された実験室で使用し、適切な個人防護具を使用してください。有機溶媒廃棄物は適切な方法で廃棄してください。

MicroCal PEAQ-ITCと互換性があると知られている溶媒のリスト:

  • pH2〜pH12の水性バッファー
  • 1 M NaCl
  • 50% DMSO
  • 50% アセトニトリル
  • 100% メタノール
  • 50% エチレングリコール
  • 20% Contrad 70
  • 14% Decon 90

MicroCal PEAQ-ITCの湿潤表面材料の一部リスト – 特定の溶媒については化学耐性ガイドを確認してください。このリストには、洗浄モジュールのすべての湿潤コンポーネント、またはPEAQ-ITCオートサンプラーで使用されるすべての材料が含まれているわけではありません。

  • ハステロイ合金C276: ITCセル
  • アセタール（「デルリン」とも呼ばれる）: ITCセルポートオーバーフローカップ
  • ステンレススチール316: 注入シリンジ、手動セルローディングシリンジ、ITCセルポート
  • ステンレススチール303: 注入シリンジナット
  • PEEK: フィルポートアダプター（FPA）、洗浄モジュール
  • カルレズ: フィルポートアダプター（FPA）
  • PTFE: 注入ピペット、注入シリンジベアリングスリーブ、手動セルローディングシリンジ
  • ホウケイ酸ガラス: 注入シリンジ、手動セルローディングシリンジ
  • タイゴン2375: 洗浄モジュールとFPAアセンブリ用のチューブ
  • ポリプロピレン: 洗浄モジュールのクイックコネクトフィッティングとフィルポートアダプター（FPA）アセンブリ
  • FEP（フッ素エチレンプロピレン）: 手動セルローディングシリンジのシース
  • 注意:一部の有機溶媒は、注入シリンジを充填する際に使用される0.2 mL チューブを柔らかくし、手動セルローディングシリンジの組み立てに使用される接着剤を劣化させる可能性があります。

有機溶媒を使用した実験の方法

有機溶媒を使用したサンプル準備:

  • ITC滴定の各結合パートナーは、同一の溶媒中にある必要があります。他の溶媒や添加剤による不一致があると、背景熱が大きくなります。
  • 乾燥した溶媒、密封されたアンプルで供給されるもの、または分子ふるいで乾燥させたものを使用してください。これにより、ITC実験中の水分汚染が減少します。
  • サンプルは純粋であるべきで、余分な材料、添加剤、溶媒などを含まないようにしてください。
  • サンプルを慎重に測り、溶媒と混合します。濃度の変化、湿気による汚染を防ぐためにすぐに使用してください。
  • ITCの前に溶媒の置換が必要な場合は、試料から適切な方法（例：凍結乾燥）によって初期溶媒を完全に除去してください。
  • 混合溶媒を使用している場合（例：50% アセトニトリル/50% 水）：これらは完全に一致させるのが非常に難しいので、適切なコントロール滴定を行ってください。
  • ITCの前にサンプルの脱気を行っても、有機溶媒には効果がない場合があります。ITCセルとシリンジに充填する際、脱ガスに注意してください。
  • 揮発性溶媒を使用している場合、溶媒の蒸発により、ITCセルとシリンジ内のサンプル濃度が保管中およびITC実験中に変更される可能性があります。

有機溶媒を用いた実験のためのMicroCal PEAQ-ITCセルおよび注入シリンジの準備

1回目の実験の前:

  • サンプルセルと基準ITCセル、注入シリンジを20% Contrad 70（または14% Decon 90）で洗浄し、その後数回の水洗でタンパク質や他の汚染物を除去します。必要に応じて繰り返し洗浄し、水を除去します。
  • 注入シリンジをメタノールで洗浄し、その後PEAQ-ITCポンプで乾燥させてメタノールを除去します。
  • 手動セル充填シリンジを使用してサンプルおよび基準ITCセルをメタノールで洗い流します。メタノールを除去します。
  • ITCセルが空の状態で60°Cにサーモスタットを設定し、30〜60分間稼働してメタノールを蒸発させます。これによりITCセルが乾燥します。
  • ITCセルを実験温度にサーモスタット設定します。
  • 基準セルに実験溶媒を充填します（水を使用しないでください）
  • サンプルセルに溶媒中のサンプルを充填します。
  • 注入シリンジに溶媒中のサンプルを充填します。

同じ溶媒での実験の間

  • 手動セルローディングシリンジを使用してサンプルセルからサンプルを除去します。手動セルローディングシリンジを使用してセルを数回溶媒で洗い流します。サンプルセルに新しいサンプル＋溶媒を充填します。
  • 注入シリンジを数回溶媒で洗浄します。注入シリンジに接続されたフィルポートアダプターを使用し、PEAQ-ITC洗浄モジュールをバイパスします。シリンジにサンプル＋溶媒を充填します。
  • 蒸発が発生した場合は、基準セル内の溶媒を交換してください。

有機溶媒での最終実験後:

  • 注入シリンジを使用してサンプルおよび基準セルから溶媒溶液を除去します。溶媒が水と相溶しない場合は、手動セルローディングシリンジを使用してITCセルを数回メタノールで洗浄します。その後、水と洗剤溶液で洗います。水で洗い流し、サンプルおよび基準セルに新鮮な水を入れたままにしてください。
  • 溶媒が水と相溶しない場合は、注入シリンジを数回メタノールで、次に水と洗剤溶液で洗い流します。水で洗い流し、メタノールで洗浄し、シリンジを乾燥させて保管します。
  • 溶媒が水と相溶しない場合は、手動セル充填シリンジを数回水とメタノールで洗浄し、その後水溶液で洗浄します。シリンジを乾燥状態で保管します。
  • 機器上のすべての有機溶媒のこぼれを掃除してください。

実験デザインとコントロール実験の提案

  • MicroCal PEAQ-ITC用: 25 °C, 19 X 2 µL注入, 150秒間隔, 500-750 rpm撹拌（有機溶媒の場合、撹拌速度は1000 rpm未満を推奨します）。
  • 注入間のベースラインがノイズが多い場合は、撹拌速度を遅くする必要があるかもしれませんし、または異なる温度が必要かもしれません。
  • ベースラインがずれる場合、これはITCセルおよび/またはシリンジ内の気泡による可能性があります。
  • 観測される熱変化が結合によるもので、別のプロセスや溶媒不一致によるものでないことを確認するために、いくつかのコントロールITC滴定を実行することが重要です。
    • 水を水に滴定する：これは、全体のITC機能のための推奨テストです。
    • 溶媒を溶媒に滴定する
    • 「リガンド/ゲスト」＋溶媒をITCシリンジで、ITCセルの溶媒のみに滴定する
    • ITCシリンジ内の溶媒のみを、「マクロ分子/ホスト」+溶媒が入っているITCセルに滴定する
    • これらのコントロール実験はすべて、小さな、再現性のある変化を各注入で示し、ノイズが少ないことが望ましいです。
  • コントロールまたは実験に対する注入熱変化が予想より大きい場合は、水分汚染や溶媒不一致の原因を探し、ITCセルおよびシリンジが洗浄されたことを確認してください。
  • 結合または結合飽和の証拠がない場合は、濃度も確認してください。

例: アセトニトリルにおけるホスト-ゲスト相互作用

  • アセトニトリル中でホスト-ゲスト認識反応のための生データITC（上部）および1セットのサイトモデルへのデータフィット（下部）
  • シリンジ中の「ゲスト」は17.5 mM、セル中の「ホスト」は0.7 mM。
  • MicroCal PEAQ-ITCで実施された実験、PEAQ-ITCソフトウェアを使用して分析。
アセトニトリル中でホスト-ゲスト認識反応のための生データITC（上部）および1セットのサイトモデルへのデータフィット（下部）

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