カロリメーターマスターへの道 Vol.9
自力でトラブルシューティング（DSC編） その1

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ここに登場する人物とストーリーはフィクションです。
テクニカルに関する内容に関しましては、大阪府立大学客員研究員　深田先生にご助言をいただいております。

ページ下の「ダウンロード」ボタンより、本文中に登場する、
「DSCトラブルシューティングまとめ」と「VP-DSC 複数ピークがある データ解析手順」がダウンロードできます。

【前回までのお話】
丸番製薬の仲村さんは、深田先生の下でVP-DSCでRNase Aの測定、解析について習得できました。

【今回のお話】

未知のサンプルの測定は始めてだけど、注意事項を遵守すれば大丈夫よね。

タンパク質の測定でパラメータ設定の目安がない場合は、こちらに示した条件での測定を試みてみてください。得られたデータに応じて、スキャン速度を上げたり、Filter periodを調整したりしてみてください。

コントロール測定の再現性もOK。ベースラインの傾きも近似しているし、サンプルデータはコントロールデータよりもCp値が下になっているのでこちらもOK。Scan5をコントロールデータとして使用して解析をする、と。

うーん、もう少し高温まで測定したほうがベースラインは引きやすかったかもしれないわ。次回は100℃まで上げて測定をしてみよう。 続いてベースラインの差し引き。ΔCpは不要なので、Subtract BaselineはYesを選択。

目的はピークトップだから、ToolsからのPick Peaksで十分ね。

補足します。前回までの解析では、フィッティングによるものとIntegrate from 0を使った方法をご案内していました。ただし、Integrate from 0では複数のピークトップを求めることができません。ただ単にピークトップだけを求めたいときには「Pick Peaks」という機能を使うと便利です。 なお、フィッティングを選ぶか、ピークトップを選ぶかは、測定する方の目的に因るため、どちらが正しい、ということではありません。

	ついでだから、フィッティングでもパラメータを求めてみようかしら。２つピークがあるデータをフィッティングするのは初めてね！モデルはNon-2 State: Cursor Initを選んで、Number of peaksは2と入力。
	ピークトップをダブルクリックして初期値を与えてOK。

	あら？初期値の緑色の線がずれてしまったわ！ソフトウェアのバグかしら？？
	とりあえず200 Iterをクリックしてフィッティングをかけてみよう。

Errorが出たわ、、、何でかしら、、、

	仲村さん。どうされましたか？

先生、フィッティングがうまくいかないんです。

	そのようですね。以前私も同じエラーが出たことがあったのですが、その時はサンプル濃度の単位が間違っていましたよ。サンプルの濃度はどれくらいでしたか？

1.44 μMです。

	私と同じトラブルですね。もう一度データを開きなおして、Normalize Conentrationボタンを押してみてください。

はい。あ！単位がmMになってます。

そうですね。濃度を直して解析しなおしてみてもらえますか？

あっ！今度は初期値がセットしたところになっているわ。

でも、フィッティングをするとまたErrorが出てきたわ。Tm2をfixして解析、と書いてあるわ。

	補足します。このようなエラーが出た場合、OKをクリックします。続いて、メニューバーのDSCからモデルを選び、これまでと同様にフィッティングの作業を実施します。

先生、フィッティングできました！

	そのようですね。でも仲村さん。フィッティングの状態はどうですか？1つ目のピークがちょっとずれていませんか？

そうですね。

	ドメインはいくつあると考えられていますか？

上司に確認してみます。

田中さん。先日お預かりしたDSC用のタンパク質ですが、ドメインは2つでよろしいですか？

え？ドメインごとにTmが違うのまでDSCでわかるのですか？

はい。今解析したのですが、明らかに２つのピークが得られました。そこで解析を行ってみたのですが、２つのピークで解析をするとフィッティングがあまり良好でなかったんです。

なるほど！実はドメインは３つあるんですよ。それも見極められますかね？

ドメイン３つですね。試してみます。

結果、期待していますよ！

先生。ドメイン３つらしいです。でも、どの辺に３つめのピークがあるのか、見極めが難しいです。

２つのピークでフィッティングしたデータを見ると、１つめのピークの前半にピークの肩が見えませんか？右のグラフの赤い矢印で示したあたりをピークトップとみなして解析してみてはいかがでしょうか？

なるほど。こんな感じでしょうか？

あと、変数は少なくした方が計算しやすくなりますから、Tm2とTm3のVary?を固定したほうがよいですね。

わっ！フィッティングがよくなりました！Chi-sqr is not reducedが見えたので、Tm2とTm3も変数にして、、、

すごいっ！

	仲村さん。なかなかよいデータではないですか！それに、ITCのときよりは、すんなりと測定ができるようになりましたね。

そうですね。気泡の混入がなければ、測定そのものはシンプルだったので、ITCのときよりは楽でした。でも、ITCのときに、溶液の充填の方法や、なぜ気泡が入るとDP値が下がるか、などを理解できていたことが役立ったと思います。

	そうですね。同じ「熱」という指標で見ていますから、データを見たときに何が起きているのか？をイメージできることはとても大切だと思います。カロリメーターは何でも測定できる魔法のツールではありません。溶液中で起きている熱量変化を単純に測定しています。反応はサンプルの発熱だけでも吸熱だけでもありません。緩衝液や外気の影響なども十分考慮する必要がありますよね。

はい、肝に銘じておきます。

	では、ちょっと休憩した後に、よくあるトラブルについてまとめてみましょうね。

よろしくお願いします！

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