다중 검출기 GPC/SEC는 어떻게 작동합니까?

작성자 Kyle Williams, Thursday, 20th June 2019

샘플이 합성 폴리머, 다당류와 같은 천연 물질, 또는 단백질, 항체, 그 외 생물학적 샘플이든 관계없이, 겔 침투 크로마토그래피 / 크기 배제 크로마토그래피(GPC/SEC)는 이러한 거대 분자 및 다른 유형의 거대 분자를 특성화하는 데 이상적인 기술입니다. GPC/SEC 분석에서 제공하는 정보에는 분자량(MW), 분자 크기로서의 유체역학적 반경(Rh) 및 회전 반경(Rg), 내재 점도(IV), 농도, 구성 분석, 그리고 분기 데이터 등을 포함한 여러 다른 매개변수가 포함됩니다. 사용 가능한 데이터는 설치된 검출기 조합에 따라 달라지며, 다양한 검출기가 결합되어 서로 다른 조각의 특성화 정보를 제공합니다. 이 게시물은 OMNISEC와 Viscotek TDA 플랫폼에서 사용할 수 있는 다양한 검출기들이 샘플을 포괄적으로 특성화하기 위해 어떻게 협력하는지를 설명합니다. 더 상세한 내용(및 수식!)은 다중 검출기 GPC/SEC 원리에 관한 백서를 참조하십시오.

검출기와 분자 매개변수의 관계는 위의 그림에서 그래프로 요약되어 있습니다. 이 차트는 각 검출기가 직접 측정하는 샘플 속성으로 시작하여, 관찰된 검출기 응답에서 직접 계산된 값으로 이동하고, 직접 계산된 데이터에서 계산된 정보로 끝납니다.

완전히 로드된 다중 검출기 GPC/SEC 시스템과 가장 일반적으로 연결된 네 가지 검출기는 차등 굴절 지수(RI) 검출기, 광산란 검출기(RALS/LALS 혹은 MALS), 차등 점도계 검출기, 그리고 UV 검출기입니다. 이러한 검출기들이 반응하는 샘플의 특정 특징은 위 그림의 하단 행에 나열되어 있습니다. RI 검출기는 샘플 용액과 빈 용매 사이의 굴절률 변화에 반응합니다. 광산란 검출기는 샘플의 분자량에 가장 강력하게 반응합니다. 더 높은 분자량 샘플은 더 강한 반응을 이끌어냅니다. 차등 점도계 검출기의 신호는 빈 용매와 비교했을 때 샘플 용액의 용액 점도 차이를 기반으로 합니다. 그리고 UV 검출기의 응답은 샘플의 흡광도 수준을 기반으로 합니다. 염료가 없어 UV 빛을 흡수하지 않는 샘플은 UV 신호를 생성하지 않습니다.

어떤 검출기가 존재하든 관계없이 모든 GPC/SEC 시스템에는 적어도 하나의 농도 검출기가 있어야 합니다. RI 및 UV 검출기는 샘플의 농도에 직접적으로 비례하기 때문에 농도 검출기로 간주됩니다. 모든 샘플이 UV 활성인 것은 아니기 때문에 대다수 시스템은 RI 검출기를 사용합니다. 샘플의 dn/dc 값 또는 굴절률 증가값을 알고 있다면, RI 검출기로부터 각 데이터 슬라이스의 샘플의 정확한 농도를 계산할 수 있습니다. 마찬가지로, UV 검출기를 사용할 경우, 샘플의 dA/dc 값, 즉 몰 소광 계수와 관련된 값을 알면 각 데이터 슬라이스의 샘플 농도를 계산할 수 있습니다. RI 및 UV 검출기를 모두 사용하면 두 가지 구성 요소로 구성된 샘플의 구성을 파악할 수 있습니다.

각 기록된 데이터 슬라이스에서 샘플의 정확한 농도를 아는 것은 중요합니다. 왜냐하면 이는 이전 계층 그림의 중간 부분에 직접 계산된 주요 분자 매개변수인 분자량과 내재 점도를 결정하는 데 필요하기 때문입니다. 위의 검출기 응답을 지배하는 방정식을 조사하면 샘플의 농도가 왜 중요한지 알 수 있습니다. 광산란 방정식에 초점을 맞춰보면, 검출기 출력이 관찰되고, KLS는 좁은 표준을 분석하여 얻은 검출기 상수를 나타내며, 분자량은 미지수입니다. dn/dc 값은 RI 검출기에서 농도를 계산하는 데 사용되는 값으로 방정식에서 알려져 있으며, 이는 광산란 방정식에 연결됩니다. 주입 부피는 사용자가 설정하므로 알려져 있습니다. 결과적으로 분자량이 유일한 미지수가 됩니다. RI 및 광산란 검출기를 조합하여 샘플의 분자량을 각 데이터 슬라이스에서 계산할 수 있습니다. 계산된 분자량은 정의된 샘플 피크에 대한 적분을 통해 계산되고, 각 분획의 상대 농도에 기반하여 분자량 모멘트가 계산됩니다.

마찬가지로 RI 및 점도계 검출기를 사용하여 각 데이터 슬라이스에서 샘플의 IV를 직접 계산하고 무게 평균 IV 값을 생성하는 과정이 발생합니다.

중간에 위치한 직접 계산된 데이터를 넘어, 계층 그림의 최상위 수준은 샘플의 분자량과 IV를 결합하여 샘플의 분자 구조에 대한 통찰을 제공하는 간접 매개변수를 계산할 수 있음을 보여줍니다.

샘플 크기는 일반적으로 자주 찾는 특성화 데이터 중 두 번째이며, Rh는 모든 샘플 유형에 가장 적합한 크기 매개변수입니다. Rg는 농도 검출기와 최소한 두 각도의 광산란 검출기가 있으면 계산할 수 있습니다(따라서 중간 계층에 위치), 하지만 샘플은 각도 의존성을 나타낼 정도로 충분히 커야 합니다. 많은 샘플, 특히 단백질은 충분히 크지 않아 Rg를 계산할 수 없습니다. 반면, Rh는 농도 검출기, 광산란 검출기, 점도계 검출기의 데이터가 분자량 및 IV 데이터를 생성할 수 있을 때 계산할 수 있습니다. Rh는 계산된 분자량 및 IV와 함께 이론적 구체에 의해 점유되는 샘플의 반경을 나타냅니다. IV는 dL/g, 즉 부피를 질량으로 나눈 것으로 설명되어, 분자량 질량 용어와 결합하여 샘플의 이론적 부피를 계산할 수 있습니다. (4/3)πr3에 기반한 구형 모델이 적용되어 r이 결정됩니다. 이는 궁극적으로 샘플의 Rh입니다.

Mark-Houwink (MH) 매개변수는 샘플의 IV를 분자량에 대해 플롯하는 MH 플롯에서 계산되어 두 가지 사이의 관계를 시각적으로 나타냅니다. 이러한 MH 플롯은 세 가지 검출기(농도, 광산란, 점도계)에 의해 획득된 데이터를 사용하며, 단일 샘플 내의 분자 구조 변화를 설명하거나 여러 샘플 간의 차이를 강조할 수 있습니다. 이러한 플롯의 일반적인 사용은 샘플 분포 내에서 분기의 범위를 식별하고 양을 측정하는 것입니다.

다중 검출기 GPC/SEC 분석은 다양한 분자 매개변수를 측정하는 일련의 검출기들을 활용하여 샘플의 다양한 측면에 관한 다양한 특성화 데이터를 제공합니다. 모든 검출기가 함께 작동하여 결과는 단일 검출기 시스템으로 접근할 수 있는 것보다 훨씬 많은 데이터를 수집할 수 있습니다. 개별 검출기의 직접 측정에 의해 특정 매개변수를 직접 계산할 수 있습니다. 그리고 그로부터 소프트웨어는 추가적으로 간접 계산된 데이터를 획득해 샘플에 대한 구조적 통찰을 제공하는 정보를 제공합니다. 이 모든 것이 샘플을 한 번 주입함으로써 가능해집니다!

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