Eine Woche im Leben eines Strukturbiologen

In der Strukturbiologie ist ein sauber gereinigtes Protein nur ein Teil des Puzzles. Um eine optimale Protein-Stabilität zu gewährleisten, ist eine Kombination von Analysemethoden erforderlich, um die Qualität Ihrer Probe vollständig zu verstehen.

Diese Fallstudie folgt einem unserer Kunden, einem Strukturbiologen, der ein Projekt betreut, bei dem das von ihm gereinigte Protein sich als signifikant instabil herausstellte. Sie veranschaulicht, wie ein biophysikalischer Ansatz mit mehreren Techniken, der ITC, DLS, DSF und DSC kombiniert, Instabilitätsprobleme aufdecken kann, die konventionelle Methoden übersehen.

Tag 1

Dave ist ein Strukturbiologe, der ein neues Protein-Ziel charakterisiert. Er begann sein Projekt mit dem Einrichten eines Reinigungsprozesses und hatte nach mehreren Monaten eine brauchbare Menge des Proteins produziert. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) zeigte einen großen monomeren Peak, SDS-PAGE zeigte ein klares Band bei der richtigen Masse und die MALDI-ToF-Analyse bestätigte die Masse.

Bevor er die Röntgenkristallographie durchführte, richtete Dave einen enzyme-basierten Assay ein, um sicherzustellen, dass das Protein aktiv war – nur um festzustellen, dass die Ergebnisse inkonsistent und sehr variabel waren.

Um herauszufinden, ob das Problem im Protein selbst, im Inhibitor, im Substrat oder in einem anderen Bestandteil des Assays lag, entscheidet sich Dave auf Anraten eines Kollegen für die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), um das Problem genauer zu untersuchen. Er bereitet seine Probe für eine Übernacht-Dialyse vor und kehrt am nächsten Morgen zurück.

Sehen Sie sich dieses kurze Video an, um mehr über die Prinzipien der isothermen Titrationskalorimetrie zu erfahren.

Tag 2

Am nächsten Tag führt Dave eine ITC-Titration mit der Microcal PEAQ-ITC durch, und die Ergebnisse ähneln keinem Lehrbuchbeispiel (Abbildung 1, links). Die Daten zeigen schwache Signale, große Fehler bei den Bindungsparametern und einen Stöchiometriewert weit unter 1 (Abbildung 1, rechts). Dies ist ein klarer Indikator dafür, dass ein erheblicher Teil des Proteins nicht kompetent für die Ligandenbindung ist und dass die Qualität der Probe, nicht das Assay-Design, die Quelle der Variabilität ist.

Tag 3

Um die physikalischen Eigenschaften seiner Proteinprobe zu verstehen, verwendet Dave dynamisches Lichtstreuen (DLS) mit dem Zetasizer Advance. Dies bestätigt das Vorhandensein von aggregiertem Proteinmaterial (Abbildung 2). Es scheint, dass das Protein empfindlich auf die Bedingungen des Konzentrationsschritts während der Reinigung reagiert, was zu einer Aggregation führt, die allein durch SEC nicht nachweisbar war.

Tag 4

Da die Aggregation als Hauptproblem identifiziert ist, zielt Dave darauf ab, die Stabilität seines Proteins zu optimieren, indem er eine Reihe von Puffern mit einem thermischen Shift-Assay screent, um Bedingungen zu identifizieren, die die Protein-Stabilität verbessern.

Dave beginnt mit einem Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF)-Screen, um die thermische Stabilität des Proteins unter verschiedenen Pufferbedingungen zu beurteilen. Sein aktuelles Instrument ist jedoch für diesen Workflow ungeeignet, da das Gerät strikt auf extrinsische Fluoreszenzfarbstoffe angewiesen ist. Der Farbstoff bindet an die hydrophoben Taschen des Proteins und verändert aktiv seine Stabilität, was ein hohes Risiko für falsch positive oder gelöschte Signale birgt.

Obwohl der Bildschirm Puffer #3 als potenziellen Kandidaten anzeigt, kann Dave den Daten nicht vertrauen. Anstatt eine schnelle, unkomplizierte Antwort zu liefern, zwingt ihn diese unbeholfene extrinsische Methode dazu, eine orthogonale Technik zu suchen, um seine Ergebnisse zu überprüfen, was den Zweck eines High-Throughput-Screens zunichtemacht. Um die DSF-Ergebnisse mit einer farbstofffreien, label-freien Technik zu bestätigen, führt Dave ein gezieltes Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC)-Experiment mit der MicroCal PEAQ-DSC durch.

Im Gegensatz zu fluoreszenzbasierten Methoden misst DSC direkt Änderungen in der Wärmekapazität des Proteins während des thermischen Entfaltens und liefert ein kalorimetrisches Signal. Es erfordert auch keine Labels oder Farbstoffe, was das Risiko von Messartefakten, die im DSF-Schritt eingeführt werden, eliminiert.

Die PEAQ-DSC-Daten bestätigen das DSF-Ergebnis: Puffer #3 zeigt eine große positive Verschiebung im apparenten Tm, wobei der Beginn des Entfaltens 22°C höher liegt (Abbildung 3, grüne Kurve). Dave hat nun eine unabhängige, quantitative Bestätigung, dass Puffer #3 sein Protein stabilisiert hat.

Zurück bei der PEAQ-ITC mit seinem reformulierten Protein beobachtet Dave ein deutlich verbessertes Ergebnis mit einem Stöchiometriewert von N=1, was die Pufferoptimierung bestätigt (Abbildung 4). Das Protein ist nun voll funktionsfähig für die Ligandenbindung.

Mit einer stabilisierten und validierten Proteinprobe in der Hand, führt Dave den Enzymaktivitätsassay erneut durch. Die Ergebnisse sind konsistent und reproduzierbar.

Aus einem ITC-Experiment hat Dave die Stöchiometrie der Proteinbindung, die Bindungsaffinität und die Enthalpie abgeleitet und weiß, dass Protein-Ligand-Paare, die den ITC erfolgreich bestehen, höhere Erfolgschancen in der Röntgenkristallographie haben. Die mit ITC erhaltenen Bindungsenergien können mit strukturellen Informationen korreliert werden.

Dave geht zur Kristallisation über und bestimmt anschließend die Struktur sowohl des freien Proteins als auch seines Komplexes mit dem Ziel-Liganden mittels Röntgenkristallographie.

Mit dem Abschluss seines Projekts überprüft Dave die Schritte, die zu einem erfolgreichen Ergebnis führten, und stellt fest, dass eine Kombination analytischer Techniken ihm ermöglichte, von einem unerklärlichen Assay-Versagen zu einem strukturell und biochemisch charakterisierten Protein zu gelangen.

Während er den Verbrauch an Material der Woche durchging, erwog Dave, wie jede Technik ein anderes Probenformat, ein anderes Präparationsprotokoll und eine andere Auswahl an Verbrauchsmaterialien erforderte. Der wissenschaftliche Wert des multi-methodischen Ansatzes war klar, aber der betriebliche Aufwand für die Nutzung eines anderen Instruments für jede Analyse war erheblich.

Aus seinen Erfahrungen in dieser Woche erkennt Dave, dass ein orthogonales und komplementäres biophysikalisches Toolkit notwendig ist, um sichere und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Ihm wird bewusst, dass jede Technik ein Teil des Puzzles liefert und zusammen das vollständige Bild ergeben. Wenn er seinen Arbeitsablauf für das nächste Projekt verbessern müsste, würde er sich auf einen höheren Durchsatz, niedrigere Verbrauchsmaterialkosten und qualitativ hochwertigere Daten konzentrieren, die es ermöglichen, die richtigen Entscheidungen schnell und sicher zu treffen.

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