Screening von rohen Reaktionsgemischen

Einführung

Das Fragment-Screening hat sich als leistungsfähiger Ansatz für die Identifizierung erster Trefferverbindungen im Arzneimittelforschungsprozess erwiesen. Das Hauptmerkmal ist, dass eine kleine Anzahl (Tausende) von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht (typischerweise < 250 Da) auf ihre Bindung an ein Ziel untersucht wird. Aufgrund der geringen Größe der Verbindungen ist es wahrscheinlicher, dass sie binden, allerdings mit geringer Affinität, und es können viele verschiedene biophysikalische Ansätze verwendet werden, darunter auch Creoptix-Sensoren. Es ist relativ einfach, Fragmente zu identifizieren, die an die meisten Bindungsstellen der meisten Ziele binden. Die Herausforderung besteht darin, die Fragmente zu größeren Trefferverbindungen mit höherer Affinität zu entwickeln, bevor man mit der Optimierung der Arzneimitteleigenschaften beginnt.

Die Affinität für eine Verbindung (Analyt, A), die an ein Ziel (Ligand, L) bindet, setzt ein einfaches Gleichgewicht voraus:

Wobei k_d die Dissoziation oder Off-Rate und k_a die Assoziation oder On-Rate ist und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante oder Affinität (K_D) das Verhältnis k_d/k_a ist. In vielen Fällen wird die Affinität verbessert, wenn Änderungen an der Verbindung zu einer langsameren Off-Rate führen. Dabei handelt es sich um eine Ratenkonstante erster Ordnung, die somit unabhängig von der Konzentration ist.

Herkömmliche Optimierungsansätze erfordern einzelne Reaktionen zur Synthese jeder Verbindung, gefolgt von der Reinigung und der Herstellung der Verbindung in einer bestimmten Konzentration, bevor die Affinität in einem Assay gemessen wird. Vernalis hat einen Ansatz entwickelt, bei dem rohe Reaktionsgemische (CRM) gescreent werden, was die Geschwindigkeit und die Synthesekosten drastisch verbessert, um Möglichkeiten zur Verbesserung der Verbindungsaffinität zu erkunden. Bei Trefferverbindungen wird eine Reihe von Reaktionen parallel durchgeführt, in der Regel in einem plattenbasierten Format, wobei die in die Trefferverbindung eingebrachten Substituenten verändert werden. Nach einer minimalen Aufarbeitung werden die resultierenden rohen Reaktionsgemische dann einzeln auf Veränderungen der Off-Rate für die Bindung an das Ziel untersucht. Eine Veränderung der Off-Rate zeigt an, dass eine Verbindung mit verbesserter Affinität gefunden wurde. Bei der ersten Demonstration eines solchen Off-Rate-Screenings (ORS)¹ wurde die Biacore-Technologie eingesetzt, um Effizienzsteigerungen in Bezug auf das Material, die damit verbundene Abfallentsorgung und die Zeit zu demonstrieren. Darüber hinaus können in den frühen Phasen eines Projekts mehr Verbindungen schnell eingestuft werden, wenn das Verständnis von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) potenziell gering ist.

Die Fähigkeit, Änderungen der Off-Rate zuverlässig zu erkennen, ist der Schlüssel zu diesem Ansatz. Die proprietäre Gitter-gekoppelte Interferometrie (GCI) bietet eine überlegene Empfindlichkeit gegenüber herkömmlichen Technologien wie Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und ermöglicht die zuverlässige Bestimmung von Off-Raten von bis zu 10 s^-1. Darüber hinaus ermöglicht die verstopfungsfreie Mikrofluidik des Creoptix WAVE eine Vielzahl von Lösungsmitteln, darunter Acetonitril und hohe DMSO-Konzentrationen, was die Palette der Chemikalien erhöht, die in rohen Reaktionsgemischen verwendet werden können.

In diesem technischen Hinweis haben wir die mit dem Creoptix WAVE erzielten ORS-Ergebnisse mit denen verglichen, die zuvor von Vernalis mit dem Biacore-Instrument erzielt wurden. Dabei haben wir retrospektiv dieselbe Bibliothek von ZRMs für zwei Ziele verwendet, die Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase 2 (aa16-407), im Folgenden als PDHK2 bezeichnet, und die N-terminale ATPase-Domäne des Hitzeschockproteins 90α (aa9-236), im Folgenden als Hsp90 bezeichnet. Vernalis hatte zuvor eine Reihe von potenten Inhibitoren für beide Mitglieder der GHKL-Familie von ATPasen identifiziert.^{2, 3, 4}

Materialien und Methoden

Off-Rate-Screening von rohen Reaktionsgemischen (CRM). Dreiundachtzig (83) CRMs und eine gereinigte Kontrollverbindung wurden mit dem WAVEdelta auf ihre Off-Raten gescreent. Ein PCH-NTA WAVEchip wurde vor der Erfassung der Zielproteine mit Nickelchlorid beladen. Anschließend wurden doppelt His6-markierte HSP90- und doppelt His6-markierte PDHK2-Proteine bei ca. 7000 pg/mm² auf den Kanälen 2 bzw. 3 erfasst. Die Kanäle 1 und 4 waren Nickel-beladen und wurden als Referenzkanäle verwendet. Die CRMs wurden 30 Sekunden lang mit einer Konzentration von etwa 20 μM in HBS-P + 1 % DMSO bei einer konstanten Durchflussrate von 250 μl/min injiziert. Die Dissoziation wurde 120 Sekunden lang zugelassen. Die Off-Raten-Bestimmung wurde mit der WAVEcontrol-Software durchgeführt.

Kinetik der gereinigten Verbindungen

Ein PCH-NTA WAVEchip wurde vor der Aufnahme der Proteine mit 0,5 mM NiCl² beladen. HSP90 und PDHK2 wurden im HBS-P-Puffer bei einer Dichte von ca. 3500 pg/mm2 erfasst. VER235377 (gereinigte Verbindung) wurde mit 30 μl/min in HBS-P + 1 % DMSO bei steigenden Konzentrationen von 27,4 nM bis 20 μM injiziert (7 Konzentrationen, dreifache Verdünnungen). Vor einer 60-Sekunden-Dissoziationsphase wurde 60 Sekunden lang injiziert. Die gesamte Wechselwirkungsanalyse wurde bei 25 °C durchgeführt, und die Daten wurden mit dem WAVEcontrol ausgewertet. Für die Datenanpassung wurde ein Langmuir 1:1-Modell verwendet, und es wurden kinetische Parameter ermittelt.

Ergebnisse

Vernalis ist Vorreiter bei der Verwendung des Off-Rate-Screenings (ORS) zur kinetischen Probenahme im Hit-to-Lead-Chemical Space.¹ Das Know-how von Vernalis auf dem Gebiet der Chemieinformatik, der Verbindungsbibliothekensynthese und der Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Analyse war für diese Benchmark-Studie von großem Wert und ermöglichte das ORS von ungereinigten Reaktionsprodukten (CRM). Das CRM-Screening ermöglicht die schnelle Identifikation von Lead-Verbindungen aus Fragmenttreffern, ohne dass Verbindungsbibliotheken gereinigt oder Proteinstrukturen verwendet werden müssen. Mit dem WAVEdelta (basierend auf der GCI-Technologie) und dem Biacore T200 (basierend auf der SPR-Technologie) wurde eine vergleichende ORS-Studie durchgeführt, um die beiden Technologien zu vergleichen und zu kontrastieren. Insbesondere wurden mit dem WAVEdelta ausgewählte Verbindungen gemessen und mit einer (mit einem Biacore T200) retrospektiv getesteten CRM-Bibliothek von Vernalis verglichen. 

Abbildung 1 zeigt Beispiele für die Off-Raten-Bestimmung ausgewählter CRMs. Bei beiden Experimenten stimmten die mit dem Creoptix WAVEdelta ermittelten Ergebnisse mit denen des Biacore T200 überein. Bei Verbindungen mit Off-Raten von mehr als 1 s^-1 konnten die sehr schnellen Dissoziationskonstanten (k_off) mit dem WAVEdelta zuverlässig bestimmt werden.

Abbildung 1: Off-Raten-Screening ausgewählter CRMs. Die Messungen wurden sowohl mit einem Biacore T200 (linkes Panel) als auch einem Creoptix WAVEdelta (rechtes Panel) durchgeführt. Mit den GCI-Daten werden die SPR-Daten reproduziert. Sie ermöglichen eine genaue und zuverlässigere Off-Raten-Bestimmung von Wechselwirkungen, die schneller als 1 s^-1 sind.

Diese Off-Raten-Screening-Studie führte zur Identifizierung des gleichen PDHK2-selektiven Treffers, der auch als gereinigte Verbindung (VER235377) auf dem WAVEdelta charakterisiert wurde. Die Kinetikparameter und die Bindungsaffinität ähnelten denen, die mit dem SPR-basierten Biacore T200 ermittelt wurden. Abbildung 2 zeigt Daten, die mit GCI (Creoptix WAVEdelta, rechte Panels) und SPR (Biacore T200, linke Panels) ermittelt wurden. Schließlich wurde von uns die gleiche PDHK2-selektive Trefferverbindung (VER235377) identifiziert.^{2, 4} Die ermittelten kinetischen Daten sind in Tabelle 1 enthalten.

	kon (M-1.s-1)	koff (s-1)	Rmax (pg/mm2)	KD (nM)
HSP90 Biacore T200	1.92x105	0.130	24.1	679
HSP90 WAVEdelta	1.82x105	0.122	25.2	669
PDHK2 Biacore T200	6.10x105	0.116	18.3	191
PDHK2 WAVEdelta	3.16x105	0.052	14.5	166

Tabelle 1: Kinetische Daten für die gereinigte Verbindung VER235377 mit HSP90 und PDHK2

Abbildung 2: Bindungskinetikdaten der gereinigten Verbindung VER235377 Die Messungen wurden sowohl mit einem Biacore T200 (linkes Panel) als auch einem Creoptix WAVEdelta (rechtes Panel) durchgeführt. Für die Proteine HSP90 und PDHK2 wurden vergleichbare Daten ermittelt.

Zusammengefasst lässt sich sagen, dass wir mit dem Creoptix WAVE Folgendes erreichen konnten:

• Bestätigung des zuvor berichteten, mit einem Biacore T200 gemessenen PDHK2-Treffers^{2, 4}
• Bestätigung des gleichen PDHK2-selektiven Treffers VER235377 und Charakterisierung in seiner vollständig gereinigten Form
• Bestätigung der VER235377 PDHK2-Selektivität mit HSP90
• Nachweis einer hervorragenden Auflösung für Verbindungen mit Off-Raten von weit über 1 s^-1, was die Fähigkeit des Creoptix WAVE zur Bestimmung schneller Off-Raten unterstreicht

Ergebnis

Die vom Creoptix WAVE gelieferten kinetischen Daten stimmen sehr gut mit den Biacore T200-Messungen überein, wie die Ergebnisse einer retrospektiv gemessenen Vernalis-Verbindungskampagne mit Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase 2 (PDHK2) und Hitzeschockprotein 90 (HSP90) zeigen. Mit seiner hohen Empfindlichkeit und der Fähigkeit, extrem schnelle Wechselwirkungen zu bestimmen, verbessert das Creoptix WAVE das Verbindungsscreening und die kinetische Analyse kleiner Moleküle, was die Entwicklung von Arzneimitteln beschleunigt und die mit der Reinigung der Ziele und Verbindungen verbundenen Kosten erheblich senkt. Das Creoptix WAVE eignet sich daher ideal für das Screening von Bibliotheken schwacher Bindemittel, die sehr schnelle Off-Raten aufweisen, z. B kleine Moleküle, Fragmente, Peptide usw. In Kombination mit einer verstopfungsfreien Mikrofluidik-Technologie, die die Untersuchung von rohen, ungereinigten Reaktionsgemischen ermöglicht, revolutioniert und beschleunigt das Creoptix WAVE den Prozess der Arzneimittelforschung.

Wichtige Erkenntnisse

Mit dem Creoptix WAVEsystem können schnelle Off-Raten schwach bindender Verbindungen in rohen Reaktionsgemischen erfasst werden.

• Verstopfungsfreie Mikrofluidik, die mit rohen Reaktionsgemischen kompatibel ist: ideal für Off-Raten-Screening und fragmentbasiertes Wirkstoffdesign
• Mit historischen SPR-Daten vergleichbare Daten: GCI-Technologie liefert ähnliche kinetische Daten wie SPR-basierte Instrumente
• Problemlose Off-Raten-Bestimmung über 1 s^-1: Das WAVEsystem misst Off-Raten von bis zu 10 s^-1 mit schnellem Übergang.

Ideal für:

• Off-Raten-Screening von Rohgemischen: kleine Moleküle, Fragmente und Peptide
• Schneller Hit-to-Lead-Fortschritt
• Leitsubstanzoptimierung

Literatur:

1. Murray, J. B. et al. 2014. Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance. An efficient method to kinetically sample hit to lead chemical space in unpurified reaction products. (Off-Raten-Screening (ORS) durch Oberflächenplasmonresonanz. Eine effiziente Methode zur kinetischen Probenahme von Hit-to-Lead-Chemical Space in ungereinigten Reaktionsprodukten.) J. Med. Chem. 57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
2. Brough, P. A. et al. 2017. Application of Off-Rate Screening in the Identification of Novel Pan-Isoform Inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase. (Anwendung des Off-Raten-Screenings zur Identifizierung neuartiger Pan-Isoform-Inhibitoren von Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase.) J. Med. Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
3. Brough, P. A. et al. 2009. Combining hit identification strategies: fragment-based and in silico approaches to orally active 2-aminothieno[2,3-d]pyrimidine inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone. (Kombination von Trefferidentifizierungsstrategien: fragmentbasierte und In-silico-Ansätze für oral aktive 2-Aminothieno[2,3-d]Pyrimidin-Inhibitoren des molekularen Hsp90-Chaperones). J. Med. Chem. 52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
4. Baker, L. M. et al. Rapid optimization of fragments and hits to lead compounds from screening of crude reaction mixtures. (Schnelle Optimierung von Fragmenten und Hit-to-Lead-Verbindungen aus dem Screening roher Reaktionsgemische). Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

Danksagung

Wir danken Dr. Natalia Matassova (Vernalis) für die Durchführung aller Experimente und Dr. Natalia Matassova und Prof. Roderick Hubbard für ihren Beitrag zu diesem technischen Hinweis.