Fluorimétrie différentielle à balayage (DSF)
Obtenez rapidement des données sur la stabilité des protéines, les formulations et les interactions biomoléculaires
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La fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) est une technique biophysique rapide qui permet d'évaluer la stabilité conformationnelle des protéines en suivant les variations de fluorescence d'un échantillon soumis à un stress thermique contrôlé. À mesure que la température augmente, l'énergie thermique perturbe la structure tridimensionnelle de la protéine, révélant des régions internes qui étaient auparavant enfouies dans son cœur hydrophobe.
Dans le cadre de la DSF extrinsèque traditionnelle, ce dépliement structurel est détecté grâce à des colorants fluorescents rapporteurs qui se lient aux régions hydrophobes nouvellement exposées. La DSF intrinsèque sans marquage repose sur la fluorescence propre des acides aminés aromatiques, tels que le tryptophane, présents dans la protéine. Lors du dépliement de l'échantillon, l'acide aminé aromatique passe d'un environnement non polaire enfoui à un environnement polaire exposé, ce qui modifie le spectre d'émission de la fluorescence intrinsèque de la protéine.
La fluorimétrie différentielle intrinsèque à balayage repose sur l'acide aminé tryptophane, qui absorbe la lumière ultraviolette à 280 nm et émet une fluorescence comprise entre 300 nm et 400 nm.
Dans une protéine repliée, à l'état natif, les résidus de tryptophane se trouvent généralement dans le cœur hydrophobe et émettent une fluorescence dont le pic se situe autour de 330 nm. Lorsque le stress thermique provoque le dépliement de la protéine, ces résidus enfouis sont exposés à l'environnement aqueux polaire environnant, ce qui entraîne un décalage du pic du spectre d'émission vers 350 nm.
En enregistrant le rapport entre ces deux longueurs d'onde d'émission (F350/ F330) au cours d'une rampe de température contrôlée, le système trace une courbe sigmoïde de dépliement thermique. L'analyse mathématique de cette courbe permet d'identifier la température de début du dépliement (Ton) ainsi que la température de fusion (T_m), correspondant au moment où 50 % de la population protéique est dépliée.
Puisqu'une température de fusion (Tm) plus élevée traduit une plus grande résistance à la dénaturation thermique, la DSF permet aux chercheurs de hiérarchiser rapidement les molécules candidates, d'évaluer différentes conditions de tampon et d'évaluer la stabilité des candidats tout au long du processus de développement de médicaments.
En outre, lorsqu'elle est combinée à des techniques de diffusion de la lumière (comme la diffusion statique ou dynamique de la lumière), la DSF intrinsèque permet de différencier le dépliement conformationnel de l'agrégation physique, offrant ainsi une analyse complète de la stabilité d'une protéine en solution.
La fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) mesure la stabilité thermique des protéines en observant les changements de conformation de celles-ci lorsque la température augmente. La différence entre la DSF extrinsèque et la DSF intrinsèque réside dans l'ajout ou non d'un colorant fluorescent rapporteur.
| Caractéristique | DSF extrinsèque | DSF intrinsèque |
|---|---|---|
| Mécanisme | Utilise un colorant fluorescent ajouté (comme le SYPRO Orange) qui se lie aux régions hydrophobes exposées lors du processus de dépliement de la protéine. | Technique sans marquage qui suit les variations de la fluorescence intrinsèque des acides aminés aromatiques (Trp/Tyr). |
| Préparation d'échantillons | Nécessite l'ajout d'un colorant et son optimisation. | Sans marquage ; mesure les protéines dans leur tampon natif. |
Limites de la DSF extrinsèque :
Limites de la DSF intrinsèque :
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Connaissances
Ressources
