Technologien zur Eigenschaftsbewertung bei der Entwicklung biopharmazeutischer Produkte: Kandidatenauswahl

Wir stellen Ihnen die zu bewertenden Punkte in jeder Phase der biopharmazeutischen Entwicklung vor und die messtechnischen Technologien von Malvern Panalytical, mit denen diese Bewertungen möglich sind. Auf dieser Seite stellen wir Ihnen die Details zur „Kandidatenauswahl“ vor.

Partikelgrößenbestimmung und Bewertung von Aggregation durch Partikelgrößenverteilung (DLS)

Größenmessung von Globinen

Es ist wichtig, das gewünschte Sample schnell und einfach aus einer großen Anzahl von Kandidaten auszuwählen. Die dynamische Lichtstreuungsmethode (DLS) kann in wenigen Minuten die Größe und den Dispersionszustand der Partikel im Sample bestimmen und über die Einschleusung und Verschmelzung von Aggregaten schnell urteilen. Die x-Achse in der Abbildung unten zeigt die Größenverteilung (hydrodynamischer Radius), während die y-Achse die Lichtintensitätsverteilung (Intensity(%)) darstellt, gemessen bei verschiedenen Globinen. In der Tabelle zeigt der Scatter-Intensitätswert von 100 % bei HbA (blau) und Hämocyanin (schwarz) einen einzelnen Peak. Andererseits zeigt Rice Hb1 (grün) und Polytaur (grau) mit abnehmendem Wert eine breitere Größenverteilung mit einer Vielzahl größerer Moleküle.

Wenn DLS angewendet wird, ist es möglich, durch Bestimmen der Partikelgröße und der Spitzenflächenanteile die Verteilung von Monomeren, Dimeren und höhergradig organisierten Oligomeren im Sample zu unterscheiden. Zudem kann DLS aus den Informationen zur Partikelgröße das Molekulargewicht schätzen und wird somit effektiv zur Bestimmung des Anteils von Aggregaten und Oligomeren im Sample genutzt.

Globinenname	Untereinheit	Bekanntes Molekulargewicht (kDa)	Peakdurchschnitt (nm)	Streuintensität-Referenz (%)	Volumen-Referenz (%)
Myoglobin	1	17.6	2.403	97.7	100
Rice Hb1	2	37	2.985	90.9	99.9
HbA	4	64.5	3.305	100	100
Polytaur	12	186	6.778	88.3	99.8
Hemocyanin	―	1720	12.36	100	100

Genauere Bewertung des Molekulargewichts und der Strukturinformationen durch den Einsatz mehrerer Detektoren (SEC-LS・Vis)

Bewertung von apo-RD und holo-RD

Bei der traditionellen Analyse, die auf dem Rückhaltevolumen von Standardproben basiert, kann es durch Strukturveränderungen im Protein zu einem vermeintlich größeren Volumen kommen, was zu einer Fehleinschätzung des Molekulargewichts führen kann. Um das genaue Molekulargewicht zu ermitteln ist es effektiv, eine Größenausschlusschromatographie (SEC) mit einem Lichtstreuungsdetektor (LS) zu verbinden und die Streulichtanalyse durchzuführen. In der untenstehenden Abbildung wurde das Repeat in Toxin Domain (RD) Protein, das sich bei der Bindung mit Ca-Ionen strukturell verändert, in Anwesenheit (holo) und Abwesenheit (apo) von CaCl₂ durch SEC gemessen. Im Vergleich der holo (feste Linie) und apo (gestrichelte Linie) Zustände zeigte sich, dass apo eine frühere Auslaufzeit aufweist und die traditionelle Methode ein Molekulargewicht von etwa 600 kDa für apo und 73 kDa für holo berechnet, was irrtümlich auf Aggregationen bei apo hinweist. Jedoch zeigte die Lichtstreuungsanalyse, dass beide Molekulargewichte tatsächlich etwa 73 kDa betrugen, wie in der Tabelle zu sehen ist. Zusätzlich wurde durch den Viskositätsdetektor festgestellt, dass die intrinsische Viskosität bei apo 0.35 dL/g und bei holo 0.055 dL/g beträgt, was auf eine signifikante strukturelle Anpassung durch die Anwesenheit von Ca-Ionen hinweist.

Durch die gleichzeitige Verwendung mehrerer Detektoren lassen sich präzise Molekulargewichts- und Strukturinformationen gewinnen, was Fehlinterpretationen bei der Konstruktionsauswahl verhindert.

Parameter	Einheit	apo-RD	holo-RD
Auslaufvolumen	mL	10.4	13.8
Intrinsische Viskosität	dL/g	0.35	0.055
Molekulargewicht	Kg/mol	73.6	73.2

Bestimmung der Partikelgröße und Bewertung von Aggregationen unter Verwendung mehrerer Detektoren (SEC-LS・Vis)

Reinheitsbewertung von Antikörpern

Streulicht neigt dazu, bei größeren Molekulargewichten stärker zu sein. Durch die Verbindung eines Streulichtdetektors mit SEC wird es möglich, klar die Bereiche der Aggregate zu definieren, die mit traditionellen RI oder UV/VIS-Detektoren schwer zu identifizieren sind. Die Ergebnisse, die hier gezeigt werden, wurden mit einem an SEC angeschlossenen RI-Detektor und Streulichtdetektor bei der Messung von IgG verwendet. Sowohl Monomer als auch Dimer wurden im RI-Signal (rot) und Streulichtsignal (orange) erkannt, jedoch zeigte der aggregierte Bereich ein stärkeres Streulichtsignal im Vergleich zum RI-Signal (roter Pfeil). RI-Detektoren und UV/VIS-Detektoren basieren auf signalabhängigen Konzentrationen, wodurch die Signale kleinerer Aggregate schwächer werden können. Durch Hinzufügen eines Streulichtdetektors ist es dann möglich, zwischen tatsächlichen Aggregaten und Baseline-Schwankungen zu unterscheiden.

Die Verwendung von SEC-LS・Vis ermöglicht es also, genauere Reinheitsbewertungen von Proben durchzuführen, was die Auswahl eines reineren und wünschenswerteren Konstruktionsansatzes ermöglicht.

Thermische Stabilitätsvergleiche zur Auswahl des Konstrukts (DSC)

Thermische Stabilitätsvergleiche bei 12 verschiedenen mit Mutationen versehenen Fab-Antikörpern

Es ist bekannt, dass Mutationen bei Proteinen zu Veränderungen der Aktivität und Stabilität führen können; eine erhöhtere Stabilität wirkt sich auch auf die Aktivität aus. Das differentielle Wärmefluss-Kalorimeter (DSC) kann ohne Markierung den thermischen Stabilitätstest von Proteinen durchführen. Die Daten im Diagramm zeigen die Ergebnisse der DSC-Messung des Wildtyp (WT) und 12 verschiedenen Fab-Mutanten verschiedener Antikörper, die Tetanus-Toxoid erkennen. Die x-Achse zeigt die Temperatur und die y-Achse die Wärmekapazität für die Denaturierung. Die T_m des WT-Fab (die Spitze des Hauptpeaks) betrug 78.7 °C, während die des mutierten V11 92 °C war, was darauf hinweist, dass dieses Konstrukt um 13.3 °C stabiler war.

Mit DSC kann verglichen werden, wie nur geringe Sequenzunterschiede in den variablen Regionen der Antikörper deren thermische Stabilität beeinflussen, und stabilere Konstruktionskandidaten können fokussierter ausgewählt werden.

Konstruktionsauswahl basierend auf Bindungsaktivität (ITC)

Interaktionen zwischen Histon-Chaperon und drei unterschiedlichen Histonpeptiden

Bei der Entwicklung von Arzneimitteln ist es wichtig, effizient eine hochaffine Verbindung zu einem Zielprotein auszuwählen. Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) kann neben der Affinität auch die Spezifität und den Bindungsmechanismus von Molekülinteraktionen in einem einzigen Schritt bestimmen.

Die folgenden Abbildungen vergleichen Interaktionen von drei verschiedenen Histonpeptiden (10-mer) mit dem PHD-Domain (plant homodomain)-Bereich des Histon-Chaperons TAF3 (TBP(TATA binding protein)-associated factor). Die oberen Diagramme zeigen die Rohdaten und die unteren Diagramme zeigen auf der x-Achse das Molverhältnis und auf der y-Achse die enthalpische Veränderung (△H), die durch die Interaktion verursacht wird. Diese Interaktionen zeigen eine einzelne sigmoidale Kurve, die auf eine typische 1:1-Bindung hinweist, wobei die Fit-Analyse Unterschiedlichkeiten in der Affinität der Peptide suggeriert. Unterschiede in der Affinität spiegeln sich in der Steigung der Kurve wider, wobei die Nähe zur vertikalen Linie auf eine stärkere Affinität hinweist, während eine flachere Kurve auf eine schwächere hinweist.

Durch den Einsatz von ITC ist es möglich, Konstrukte mit höherer Affinität auszuwählen.

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