Physikalische Bewertungstechniken in der Entwicklung von Biopharmazeutika: Qualitätskontrolle

Wir präsentieren Ihnen die zu bewertenden Punkte in den einzelnen Entwicklungsphasen von Biopharmazeutika sowie die Messmethoden von Malvern Panalytical, mit denen diese Bewertungen möglich sind. Auf dieser Seite stellen wir Ihnen die Details zur „Qualitätskontrolle“ vor.

Polydimensionale Größenbewertung mit mehreren Detektoren (SEC-LS·Vis)

Bewertung des absoluten Molekulargewichts und der Intrinsic Viscosity von β-Amylase

Kombiniert man die Größenausschlusschromatographie (SEC) mit einem Lichtstreudetektor (LS), kann das absolute Molekulargewicht ermittelt werden. Dieses korreliert mit dem Gewicht des Moleküls: je schwerer das Molekül, desto größer das Streulicht, während leichtere Moleküle weniger Streulicht erzeugen. Das untenstehende Bild ist das Messergebnis der β-Amylase im SEC-LS-Verfahren. Bei der Kalibrierung gewonnene Molekulargewichte zeigen, dass der vordere Peak ein Aggregat und der hintere ein Monomer ist. Wenn jedoch ein Lichtstreudetektor zur Analyse des absoluten Molekulargewichts verwendet wird, zeigen beide Peaks fast das gleiche Molekulargewicht, wie in der Tabelle dargestellt, was darauf hindeutet, dass ihre Struktur unterschiedlich ist, da ihre intrinsic Viscosity-Werte unterschiedlich sind. Eine unterschiedliche Struktur bedeutet unterschiedliche Volumina, weshalb zwei Peaks erscheinen.

Auf diese Weise ermöglicht die Bewertung mit verschiedenen Parametern durch SEC eine detaillierte und präzise Größenvergleiche von formulierten Proteinen.

T_m und T_1/2-basierte Vorhersage der Destabilisierung (DSC)

Einfluss der erzwungenen Oxidation auf die thermische Stabilität von Antikörpern

Mit der Differenzkalorimetrie (DSC) lassen sich die Auswirkungen von Oxidation, die während der Lagerung oder des Transports nach der Formulierung auftreten, anhand der thermischen Stabilität bewerten. Das folgende Bild zeigt die Ergebnisse der DSC-Messungen von Antikörpern vor und nach erzwungener Oxidation. Beim oxidierten Sample zeigt sich eine Abnahme der Zersetzungstemperatur T_m1 und eine Verbreiterung der ersten Peak, während das Hauptpeak T_m2 kaum beeinflusst ist. Dies legt nahe, dass die Oxidation das Fc-CH2-Domän destabilisiert hat.

Mit DSC lässt sich daher bewerten, welches Domän von Antikörpermedikamenten durch Oxidation beeinträchtigt wird.

Bewertung der Bindungstätigkeit anhand von Enthalpieänderungen (DSC)

Korrelation zwischen der thermischen Stabilität von gp120 und der Bindungsaktivität mit CD4

DSC-Daten überlappen sich vollständig, wenn die hohe Struktur des Musters erhalten bleibt und die Messung unter denselben Konzentrations- und Pufferbedingungen erfolgt. Bild (a) unten zeigt die DSC-Daten von gp120-Proteinen aus verschiedenen Chargen. Die Spitzenwerte befinden sich bei etwa 61 °C, aber die Unterschiede in der Höhe der Spitze zeigen Unterschiede an. Bild (b) zeigt die Entropieänderung aus (a) auf der x-Achse und die Bindungsaktivität mit CD4 auf der y-Achse. Ein linearer Zusammenhang zwischen der Entropieänderung und der Bindungsaktivität wird sichtbar, wo eine verringerte Entropieänderung andeutet, dass inaktive Moleküle in der Charge vorhanden sind.

DSC ermöglicht somit die Qualitätsbewertung nach der Produktion.

Bewertung der Äquivalenz anhand der Peakform (DSC)

Äquivalenzbewertung zwischen verschiedenen Antikörperchargen

DSC-Thermogramme zeigen, ob die hochstrukturierte Form eines Moleküls bewahrt geblieben ist und denselben Fingerabdruck unter gleichen Konzentrations- und Pufferbedingungen aufweist. Abweichende Peakformen bedeuten teilweise instabile Probenstrukturen, während ähnliche Formen mit kleinerem Volumen als Hinweis auf bereits denaturrierte Proben im Lösungsmittel interpretiert werden können.

Das untere Diagramm zeigt die Äquivalenzbewertung der Antikörperchargen nach der Formulierung. Da sich die Thermogramme gut decken, schlagen Indizien auf, dass zwischen den Chargen Äquivalenz erhalten bleibt.

Mit DSC können so Äquivalenzbewertungen von Proteinpräparaten zwischen Chargen und Standorten durchgeführt werden.

Äquivalenzbewertung anhand von Affinität und Bindungsverhältnis (ITC)

Bewertung der Bindungsaktivität von Proteinen mit verschiedenem Chargenhintergrund

Das Bindungsverhältnis (n) aus der Isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) wird durch die „Spritzen-Probendichte/Zellprobendichte“ auf der x-Achse dargestellt. Oft findet man das Protein in der Zelle, wodurch sich seine Bindungsaktivität durch Vergleich des Bindungsverhältnisses bewerten lässt. Das untere Diagramm zeigt die Bewertung der Bindungsaktivitäten eines Proteins zwischen unterschiedlichen Chargen durch ITC. Als Referenz wurde ein Peptid in der Spritze gefüllt. Die Steilheit der entstandenen Kurven ist nahezu identisch, wobei die Affinität bei Charge 1 bei 97,1 nM und bei Charge 2 bei 135 nM liegt, was auf keinen signifikanten Unterschied hindeutet. Jedoch weist Charge 1 ein Bindungsverhältnis von 1,05 Sites und Charge 2 ein Bindungsverhältnis von 0,235 Sites auf, was nahelegt, dass die Bindungsaktivität des Proteins in Charge 2 nur zu etwa 24 % erhalten geblieben ist.

Wie dieses Beispiel zeigt, kann ITC genutzt werden, um zu bewerten, ob die Bindungsaktivität eines Proteinpräparats über Chargen und Standorte hinweg erhalten bleibt.

Größen- und Größenverteilungsevaluation anhand von Partikelgröße und PdI (DLS)

Vergleich der kolloidalen Stabilität von Antikörpern unter verschiedenen Lagerbedingungen

Die Lagerbedingungen von Antikörpern beeinflussen deren Qualität erheblich. Durch die Messung der Partikelgröße mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) lässt sich bestimmen, ob die verwendeten Bedingungen optimal sind.

Die folgende Abbildung zeigt die Messergebnisse der Partikelgröße von IgG bei unterschiedlichen Lagerbedingungen. Bei Lagerung für 35 Tage bei 4 °C (grün) wurden keine Aggregate festgestellt und der PdI (Polydispersitätsindex) war gering. Bei fünfmaligem Einfrieren/Auftauen (rot) hingegen traten Aggregate mit einem sehr hohen PdI auf. In der Probe bei 25 °C über 31 Tage (blau) wurden kaum Aggregate festgestellt, aber der PdI war leicht erhöht. Zur detaillierteren Bewertung der Lagerbedingungen ist es daher sinnvoll, sowohl die Partikelgröße als auch den PdI zu vergleichen.

Durch die Anwendung von DLS zur Bewertung von Größe und Partikelgrößenverteilung von formulierten Proteinen unter verschiedenen Lagerbedingungen lässt sich eine Optimierung der Lagerbedingungen erreichen.

Zeitliche Bewertung von SVP durch Streulicht (NTA)

Zeitliche Beobachtung von SVP bei Antikörpern unter extremen Bedingungen

In der Qualitätskontrolle wird oft die Bewertung von Arzneimitteln durch beschleunigte Versuche gefordert. Neben der Partikelgröße kann hierbei die Partikelkonzentration als Parameter durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) hinzugefügt werden, um die Bewertung zu detaillieren. Das untenstehende Beispiel zeigt die Bewertung von IgG unter extremen Bedingungen mittels NTA. Wenn 1 mg/mL IgG bei 50 °C erhitzt wird, kann man die Entstehung von SVP beobachten: Die Konzentration der SVP nimmt mit der Zeit zu und größere Aggregate entstehen.

Durch die Nutzung von NTA kann eine quantitative Bewertung von SVP erfolgen.

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