Physische Bewertungstechniken in der Entwicklung biopharmazeutischer Produkte: Formulierungsstudie
In verschiedenen Phasen der Entwicklung von Biopharmazeutika präsentieren wir die zu bewertenden Elemente und die bewertungsmöglichen Messtechniken von Malvern Panalytical. Auf dieser Seite stellen wir Details zur „Formulierungsstudie“ vor.
Bewertung der Dispersionsstabilität mittels Diffusionskoeffizient(DLS)
Vergleich der Diffusionskoeffizienten unter verschiedenen Formulierungsbedingungen basierend auf der Konzentrationsabhängigkeit von Antikörpern
Für Biopharmazeutika kann die Dispersionsstabilität bewertet werden, indem der mit der dynamischen Lichtstreuungsmethode (DLS) ermittelte Diffusionskoeffizient gegen die Konzentration aufgetragen wird. Das folgende Diagramm zeigt die mit DLS gemessenen Veränderungen des Partikeldurchmessers in Bezug auf Konzentrationsänderungen von in verschiedenen Puffern dispergierten IgG-Antikörpern.
Im Puffer 1 (links im Diagramm) steigt der Partikeldurchmesser mit zunehmender Konzentration an und der Diffusionskoeffizient nimmt ab. Im Gegensatz dazu verringert sich im Puffer 2 (rechts im Diagramm) der Partikeldurchmesser und der Diffusionskoeffizient nimmt zu. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die scheinbare Zunahme des Diffusionskoeffizienten in Puffer 2 durch die elektrostatische Abstoßung zwischen Molekülen beeinflusst wird. Das folgende Diagramm zeigt den Diffusionskoeffizienten in Abhängigkeit von der Konzentration, wobei ein negativer Gradient (blau) auf eine niedrige Dispersionsstabilität und ein positiver Gradient (rot) auf eine hohe Dispersionsstabilität und weniger Aggregate hinweisen.
So kann durch die Verwendung von DLS die Dispersionsstabilität von Proben unter verschiedenen Formulierungsbedingungen bewertet werden.
Bewertung der Dispersionsstabilität mit dem zweiten Virialkoeffizienten(SLS)
Vergleich des zweiten Virialkoeffizienten für unterschiedliche Formulierungsbedingungen basierend auf der Probenkonzentration
Die statische Lichtstreuungsmethode (SLS), eine der Methoden der Lichtstreuung, ermöglicht die Bestimmung des Molekulargewichts und des zweiten Virialkoeffizienten (B22) einer Probe, wodurch Aussagen zur Dispersionsstabilität gemacht werden können. Das obere Diagramm zeigt die Bewertung der Dispersionsstabilität von Lysozym in Pufferlösungen mit unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen durch SLS. Mit Bezug auf die NaCl-Konzentrationen wurde der B22-Wert berechnet, indem die Protein-Konzentration variiert und KC/Rθ aufgetragen (Debye-Plot) wurde. Dieser Parameter zeigt die Beziehung zwischen Lösungsmittel und gelöstem Stoff an, wobei grundsätzlich ein positiver B22-Wert mit einer stabilen Dispersion bei Proteinen in Verbindung steht. Daraus kann gefolgert werden, dass in einem Puffer ohne NaCl die Dispersionsstabilität von Lysozym erhöht ist.
Das untere Diagramm zeigt den Vergleich des B22-Werts eines Antikörpers in verschiedenen Puffern. Die Ergebnisse zeigen, dass die Dispersionsstabilität im Puffer 2 höher ist.
Durch die Anwendung von SLS kann die Dispersionsstabilität von Proteinen unter verschiedenen Formulierungsbedingungen bewertet werden.
Bewertung der Dispersionsstabilität mit elektrophoretischer Lichtstreuung(ELS)
Vergleich des Zeta-Potentials von Antikörpern unter verschiedenen Formulierungsbedingungen
Das Zeta-Potenzial, ein Maß für die Dispersionsfähigkeit einer Probe, wird durch elektrophoretische Lichtstreuung (ELS), eine Methode der Lichtstreuung, bestimmt und hängt vom Molekül und der umgebenden Lösung (Puffertyp) ab. Im folgende Diagramm werden die Zeta-Potenzialwerte von IgG in verschiedene Pufferlösungen dargestellt. Bei ELS wird die Salzkonzentration erhöht, wodurch die Messung instabil werden kann, weshalb Mehrfachmessungen zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Im Puffer 1 (blau) ist das Zeta-Potenzial niedrig, und die durch Berechnung von der elektrophoretischen Mobilität erhaltene Ladung (nicht dargestellte Daten) ist ebenfalls gering (0,8), wodurch eine geringe Stabilität und eine dipolare Wechselwirkung nahegelegt wird. Im Puffer 2 (rot) sind das Zeta-Potenzial und die berechnete Ladung hoch (6,5), was auf eine hohe elektrostatische Stabilität hindeutet.
Durch die Anwendung von ELS kann die Dispersionsstabilität von Molekülen unter verschiedenen Formulierungsbedingungen, die durch gegenseitige Oberflächenwechselwirkungen entstehen, bewertet werden.
Tm und Tagg als Indikatoren für eine thermische Stabilitätsbewertung(DLS)
Vergleich der thermischen Stabilität von Rh-Dominan in 10 unterschiedlichen Formulierungsbedingungen
Bei der Entwicklung eines medizinisch wirksamen Inhaltsstoffs (API) ist es wichtig, eine Formulierung zu entwerfen, die unter den empfohlenen Umgebungsbedingungen eine ausreichende Stabilität auch bei Langzeitlagerung bietet.
Bei DLS kann die Temperatur, bei der Aggregation beginnt (Tagg), durch Partikelgrößenänderungen unter Temperaturerhöhung erhalten werden, und die thermische Stabilität in unterschiedlichen Lösungsmittelbedingungen kann bewertet werden. Bedingungen mit hoher thermischer Stabilität werden als ebenso stabil bei Langzeitlagerung angesehen. Das untenstehende Diagramm zeigt ein Aufheizmessergebnis von Rh-Dominan, dispergiert in Puffern bei verschiedenen pH-Werten, gemessen mit DLS. Die meisten der bei einem pH-Wert von 3 bis 10 eingemischten Proben zeigten ähnliche Tm (67 bis 68 °C). Zwei bei pH 6 formulierte Proben (roter Rahmen) begannen erst mit der Aggregation, wenn die Tm 74 °C überstieg, und zeigten die größte thermische Stabilität. Im Gegensatz dazu wiesen zwei bei pH 3 (grün) und pH 4 (gelb) formulierte Proben bereits zu Beginn der Erwärmung größere Partikelgrößenveränderungen auf, was auf einen denaturierten Zustand hinweist.
Durch die Durchführung von DLS-Erhitzungstests können somit die thermischen Stabilitäten unter verschiedenen Formulierungsbedingungen bewertet werden.
Tm und T1/2 als Indikatoren für eine thermische Stabilitätsbewertung(DSC)
Vergleich der thermischen Stabilität von Antikörpern in 19 verschiedenen Formulierungsbedingungen
Die Formulierungsbedingungen für Biopharmazeutika (Puffertyp, pH, Additive usw.) können eingegrenzt werden, indem die thermische Stabilität von Proben in unterschiedlichen Lösungen durch Differential Scanning Calorimetry (DSC) bewertet wird. Oben ist das DSC-Diagramm von Antikörpern unter drei verschiedenen pH-Lösungsbedingungen dargestellt. Bei pH 3,5 verschiebt sich der Hauptgipfel in der Position im Vergleich zu pH 5,5 und 6,2 und die Denaturierungstemperatur sinkt, was auf eine verringerte thermische Stabilität hinweist. Das mittlere Diagramm zeigt die Vergleichsmessung der Denaturierungstemperatur (Tm) eines Antikörpers bei unterschiedlichen Puffern, pH-Werten und 19 Bedingungen mit DSC. Bei den Bedingungen von Acetat 5,0 bis Tris 7,5 zeigten 12 Bedingungen ähnliche Tm (mittlerer roter Pfeil) und wurden als Bewerber für die Formulierung betrachtet. Für die endgültige Auswahl wird normalerweise dieses Verfahren verwendet, und zusätzlich wird im unteren Diagramm die T1/2 als Differenz bei gleicher Bedingung des mittleren und gleichen Antikörpers nach Einstellung (blau) und (gelb) T1/2 betrachtet. Eine geringere Differenz von T1/2 bedeutet stabilere, kompakte Struktur, die finalbedingungen wurden (unterer roter Pfeil) eingegrenzt. Basierend auf mehreren Parametern, die durch DSC erhalten wurden, kann die thermische Stabilität von Proben unter unterschiedlichen Pufferbedingungen verglichen werden, um bessere Formulierungsbedingungen zu bestimmen.
Durch die Verwendung mehrerer Parameter, die durch DSC erhalten werden können, können bessere Formulierungsbedingungen durch den Vergleich der thermischen Stabilität von Proben in Pufferlösungen unter unterschiedlichen Bedingungen bestimmt werden.
Quantifizierung von Proteinaggregaten durch Streulicht(NTA)
In der Entwicklung von Medikamenten ist es wichtig, Sub Visible Particles (SVP) zu erkennen und zu quantifizieren.
Das Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) setzt Laser direkt ein, um Partikel in Lösungen zu bestrahlen, und erfassen das Streulicht mit einer Kamera and damit Submikrometer- und Nanoteilchen, die mit einem optischen Mikroskop nicht sichtbar sind, ab einer minimalen Größe von 10 nm* zu erkennen. Mit der Bildverarbeitung verfolgt (traced) NTA die Brownsche Bewegung und berechnet den Partikeldurchmesser aus dessen Geschwindigkeit. Proteinaggregate können ab 50 nm erkannt werden, wodurch eine Lücke zwischen mikroskopischen, Durchflusszytometrie- und chromatografischen Analysemethoden geschlossen wird.
Im folgenden Diagramm werden Proteinaggregate in Pufferlösungen detektiert, deren Streulicht auf einem erkennbaren Level stärker wurde. Die horizontale Achse zeigt die Größe, während die vertikale die Anzahl der Partikel zeigt.
Durch die Anwendung von NTA können Aggregate, die mit herkömmlichen Methoden schwer zu erkennen sind, visuell bestätigt werden, was die Auswahl besserer Formulierungsbedingungen unterstützt. *Abhängig von Teilchenmaterial und -dichte
Quantitative Bewertung von SVP unter verschiedenen Formulierungsbedingungen durch Streulicht(NTA)
SVP-Detektion von Insulin mit vier verschiedenen Antioxidantienzusätzen
NTA errechnet die Teilchenkonzentration basierend auf dem bekannten Messgebiet, was die Quantifizierung von SVP ermöglicht. Im folgenden Diagramm wird die SVP eines 1 mg/ml Insulins mit verschiedenen 100 µM Antioxidantienzusätzen bei 4 °C nach 72 Stunden gezeigt. Die horizontale Achse zeigt die Größe, die vertikale die Anzahl der Partikel. Insulin in PBS ohne Antioxidantien (A) hat eine niedrige SVP-Konzentration. Je nach Antioxidanssamenzusatz treten mehr aggregierte Partikel (B, D, E) oder keine (C) auf.
Durch NTA können SVP-Konzentrationen quantitativ bewertet werden, was die Wahl besserer Formulierungsbedingungen unterstützt.
Thermische Stabilitätsbewertung durch Änderung der Partikelgrößenverteilung(DLS)
Vergleich von Größenänderungen während beschleunigten Tests von ConA mit vier verschiedenen Zuckerzusätzen
Durch DLS sind thermische Stabilitätsbewertungen durch Zuckerzusätze zu Proteinformulierungen möglich.
Das folgende Diagramm zeigt die DLS-Temperaturmessung von Concanavalin A (1 mg/mL) mit verschiedenen Zuckern (10 mM), um die thermische Stabilitätsveränderung durch Bindung an verschiedene Zucker zu messen. Die horizontale Achse zeigt die Größe, die vertikale die Lichtintensität (Intensity(%)). Im oberen Diagramm bei 35 °C ist die Probenlösung monodispers verteilt, und die Positionen der Spitzen sich überschneiden. Im unteren Diagramm bei 47 °C zeigt sich, dass die Aggregate je nach Zuckerzusatz verschieden sind (Größe, Menge).
Hauptspitze (circa 10 nm): Ohne Zucker (violett) und Galactose (grün) weichen stark zurück und aggregieren, während Glucose (blau), Fructose (schwarz), und Mannose (rot) sich verbändert und die thermische Stabilität verbessert scheint.
Durch Nutzung von DLS können die Auswirkungen thermischer Stabilität durch unterschiedliche Additive bewertet werden, was unterstützend zur optimalen Formulierungsbedingungswahl ist.
Bewertung der Stabilität basierend auf Größenänderungen (SEC-LS)
Bewertung von Antikörperaggregation, -fragmentierung und -dissoziation durch beschleunigte Tests
Zur Stabilitätsbewertung von Proteinformulierungen mit beschleunigten Tests wird häufig die Größenausschlusschromatographie (SEC) eingesetzt.
Im folgenden Diagramm wurden IgG-Antikörper in einer Ampulle gesetzt und die nach Erwärmung der Probe in einem Wasserbad in SEC gemessenen Ergebnisse gezeigt. Wenn Anpassungen bei 60 °C für 135 Minuten (violett) gehalten wurden und mit der unmittelbar vorhandenen Probe (rot) verglichen werden, zeigt die angepasste eine größere Monomer- und weniger Dimerverhältnisse an. Eine Probe bei 60 °C für 60 Stunden (grün) beschleunigte die Aggregation und größere Aggregate (roter Pfeil: RV 6 mL Bereich) wurden festgestellt. Zudem wurde ein Fragment bei der Monomer-Peak-Nachlaufphase (gelber Pfeil: RV 10 mL Bereich) sichtbar.
Durch die SEC können Bewertungen von Aggregation und Fragmentierung durch beschleunigte Tests durchgeführt und bessere Formulierungsbedingungen gewählt werden.
| Molekulargewicht (Da) (Gehalt (%) ) | ||||
| Aggregat | Dimer | Monomer | Unbestimmt | |
| Start | 654,500 (4.5) | 294,500 (14.3) | 147,100 (81.2) | — |
| 60 °C / 135 Min | 547,100 (1.8) | 293,500 (5.2) | 145,900 (93.0) | — |
| 60 °C / 60 Std | 3,081,000 (1.2) | 588,400 (9.6) | 156,800 (75.0) | 133,400 (17.2) |
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