Der Weg zum Kalorimeter-Meister Vol.10 Das finale Gespräch: Alles über Kalorimeter mit Experten

von Malvern Panalytical, Thursday, 17th November 2016

Dieses Mal haben wir Professor Fukada von der Universität Osaka Prefecture und Professor Lee vom Protein Research Institute der Universität Osaka eingeladen, um über verschiedene Aspekte des Kalorimeters zu sprechen. Von ihren Anfängen der Messungen mit dem Kalorimeter bis zu ihren aktuellen Forschungen und den häufigsten Fragen, die sie von Nutzern erhalten, sprachen sie detailliert.
Sie können die Literaturliste, die in diesem Text erwähnt wird, herunterladen.
▶Zum Literatur-Download

1. Was hat Sie dazu veranlasst, mit der Wärmemessung zu beginnen?

Meine Erfahrung mit der Kalorimetrie beträgt etwa 13 Jahre, aber begonnen habe ich autodidaktisch mit ITC. Der Auslöser war Forschung, die NMR (Kernspinresonanz) Spektroskopie anwendet. Ich untersuchte die Bindung eines Enzyms mit seinem Partner mit NMR in Lösung und fand auf Aminosäure-Restebene heraus, dass die Fluktuation des Enzyms zunahm. Normalerweise wird angenommen, dass die Struktur eines Proteins bei Bindung steifer wird. Natürlich wird der Bindungsort steifer, aber in anderen Teilen traten Fluktuationen auf. Betrachtet man die Beziehung ΔG = ΔH – TΔS, dachte ich, dass sich bei der Bindung das Protein lockert (Zunahme der Fluktuation) und die Unordnung des Systems zunimmt. S, die Entropie, spiegelt die Unordnung des Systems wider, also dachte ich, dass der Prozess effizienter wird, wenn ΔS angehoben wird (in diesem Fall Konformationsentropie) und ΔG (Gibbs’sche freie Energieänderung) gesenkt wird. ΔH ist die Enthalpieänderung, und T ist die Temperatur.
Zur gleichen Zeit begannen in den USA und Europa Forschungsarbeiten über die Zunahme von Proteinfluktuationen durch Bindungen veröffentlicht zu werden. Ich fühlte mich ermutigt, dies ebenfalls zu propagieren, aber damals wurde es von anderen Professoren abgelehnt. Man sagte mir, dass eine Binderung keine Fluktuationen hervorrufen könne.
Um dies zu belegen, forschte ich und konzentrierte mich darauf, dass ΔS durch ITC bestimmt werden kann. Zufälligerweise gab es in unserem Labor ein MicroCal VP-ITC; ich begann mit Messungen unter Anleitung des Handbuchs. Ich führte ITC-Messungen bei unterschiedlichen Temperaturen durch, um ΔH für jede Temperatur zu ermitteln. Aus der Temperaturabhängigkeit von ΔH kann ΔCP (Änderung der Wärmekapazität bei konstantem Druck) bestimmt werden, und aus der empirischen Formel über den Entropiebeitrag des Wassers kann die Dehydratation ΔS bestimmt werden. Ich verwendete eine stark vereinfachte Beziehung, aber durch einfache Berechnungen der Dehydratation ΔS und des Gesamt-ΔS, die man aus ITC erhält, lässt sich die Veränderung der Konformationsentropie bestimmen.
So kam ich zu dem Ergebnis, dass ähnlich den Ergebnissen aus NMR, auch mit ITC und Analyse bewiesen werden konnte, dass die Konformationsentropie des Enzyms zunimmt und den Komplex stabilisiert. Schon im Studium mochte ich Physikalische Chemie, besonders Entropie, die den natürlichen Verlauf repräsentiert.
Ich habe bereits während meiner Abschlussarbeit Wärmemessungen durchgeführt. Mein Doktorvater, Prof. Katsutada Takahashi, war der erste in Japan, der sich intensiv mit biochemischer Kalorimetrie beschäftigte. Von dort aus habe ich weiterhin Kalorimetrie betrieben und bin dabei geblieben.
Prof. Lee erwähnte, dass er keine Anerkennung fand, als er die Zunahme von Fluktuationen durch Bindung präsentierte. Ähnlich, vor etwa 40 Jahren, sagte ein Chemieprofessor, dass es seltsam sei, wenn die Entropie bei der Bindung zunehmen würde. Natürlich, wenn Konformationsentropie oder Hydratation keine Rolle spielen, dann ist die Änderung in Entropie negativ.
Ich glaube, Diskussionen über Dehydratation und Protein-Faltung begannen damals aufzukommen? Entropieänderungen durch Dehydratation etc. Die Arbeit von Prof. Fukada, über die Enthalpieänderung bei der Deprotonierung von Pufferlösung, ist beeindruckend (Literaturhinweis 1).
Da ich einen agrarwissenschaftlichen Hintergrund habe, wurde meine Forschungsarbeit oft damit kritisiert, nicht zur Agrarwissenschaft zu gehören.
Doch Prof. Takahashi schätzte diese Forschung, weshalb er mir die Mittel bereitstellte. Unser Labor war auf Grundlagenerforschung in der biologischen physikalischen Chemie fokussiert, aber ohne seine Zustimmung hätte ich viele der Messungen nicht durchführen können.
Ich finde, dass solche grundlegenden Forschungsarbeiten weiter beleuchtet werden sollten.
Bezüglich der Grundlagen zur Pufferlösung, das war es natürlich nicht wortwörtlich. Chemische Forscher verwenden diese Systeme nicht. Meine erfassten Daten sind wohl eher als grundlegende praktische Daten zu sehen.

2. Erzählen Sie uns von Ihrer aktuellen Forschung.

Derzeit konzentriere ich mich auf die Aggregation von Proteinen, die verschiedene Krankheiten verursachen. Protein-Misfolding- und Aggregation-assoziierte Erkrankungen werden Protein-Misfolding-Erkrankungen genannt. Wenn Proteine falsch gefaltet werden und aggregieren, neigen sie zur Krankheitsbildung. Alzheimer, Parkinson, Typ-2-Diabetes und Prionenkrankheiten sind typische Beispiele. Als ich begann, Literatur zu lesen, wurden etwa 20 Krankheiten im Zusammenhang mit Protein-Misfolding und Aggregation genannt. Vor kurzem ist diese Zahl jedoch auf über 40 gestiegen. Die Zahl der Patienten ist je nach Krankheit nicht hoch, aber neue Erkrankungen im Zusammenhang mit Aggregation werden zunehmend erkannt. Man kann das Phänomen der Aggregation nicht länger ignorieren.
Ich konzentriere mich auch auf Insulinforschung. Insulin bleibt stabil und zeigt eine native Struktur bei saurem pH-Wert. Mit steigendem pH-Wert wird es vom Dimer zum Hexamer komplexer. Bei pH 2 ohne Metallionen existiert es als Monomer. Wenn man Insulin mit DSC bei ansteigender Temperatur misst, denaturiert es wärmeinduziert und zeigt ein Verlängerungsereignis. Ein endothermer DSC-Peak ist beobachtbar, und mit steigender Temperatur tritt ein enormer exothermer DSC-Peak auf, der Reaktionswärme zeigt. Nach der Reaktion kehrt die Antwort auf das Ausgangsniveau zurück.
Nachdem die Messung abgeschlossen ist, zeigt sich, dass sich Insulin zu schönen Amyloid-Fasern verfestigt hat. Dieses Ergebnis ist gut reproduzierbar, auch von anderen Forschungsgruppen berichtet. Aber ich untersuche andere Lösungsmittelbedingungen. Wunderlicherweise kann man Insulin trotz Aggregation mit DSC messen. Andere Aggregate sind weniger reproduzierbar. Vor Allem sinkt die DSC-Basislinie (Cp-Linie) mit vorgefertigten Amyloid-Fasern oder Aggregaten. Der Grund für den Baseline-Abfall ist mir noch unklar, was eine Herausforderung für die Zukunft darstellt. Bei erhöhter Temperatur werden hydrophobe Wechselwirkungen intensiviert, und thermisch denaturierte Proteine formen Aggregate. Diese Aggregate sind groß und setzungsanfällig. Auch neigen sie zur Ablagerung an DSC-Zellen, was Messungen erschwert. Eine einheitliche Meinung zu alldem gibt es noch nicht. Mit VP-Capillary DSC lässt sich die Aggregation etwas hemmen, was gut für die thermische Stabilität globulärer Proteine ist.
Deshalb begann ich, Proteinaggregation mit ITC zu erforschen. Wenn man in der Zelle die Probe rührt, sinken Aggregate nicht ab und erreichen keine Größe, in der sie ausfallen. Somit ermöglicht es ITC, auch in Lösung dispergierte Aggregate reproduzierbar zu messen. Ein Paradebeispiel für den Erfolg ist die Aggregation der Amyloid-Fasern des für Dialyse-Amyloidose verantwortlichen β2-Microglobulins (Literaturhinweis 2 Ikenoue und Lee et al. PNAS (2014)). Ebenso nutze ich ITC für die Insulinaggregation. Ich plane, alle zwischen Insulin möglichen Strukturzustände thermodynamisch zu untersuchen, mit ITC und DSC. Die Wärme beim Falten, Kristallisation von der native Struktur, Faltung zu Amyloid, Dimerisierung und Hexamerisierung, Metallionenbindung – all dies ließe sich mit ITC und DSC bestimmen.
Zusammengefasst könnte man damit eine thermodynamische Energielandschaft der Strukturveränderungen und intermolekularen Wechselwirkungen des Proteins Insulin zeichnen.
Das ist großartig. Insulin ist für mich eine nostalgische Probe. Es war mein erstes Proteinsample in der Graduiertenschule. Damals habe ich Zink entfernt und es mit Laugen zu Monomerbedingungen gemacht. Wir maßen die Reaktionswärme bei der Reduktion von Disulfidbindungen darin.
Zu der damaligen Zeit gab es noch nicht die Kalorimeter, die wir heute haben. Wir maßen die Reaktionswärme bei konstanter Temperatur mit Dewar-Flaschen und Thermistoren. Rund 20 mL Probe war nötig.
Das war eine enorme Menge. Selbst heute gibt es noch kostspielige Fälle, bei denen es teuer ist, wenn man ohne Expressionssystem aufgekaufte Proteine oder Peptide verwendet.

3. Die Entwicklung von ITC aus Sicht der Anwender

Ich habe hauptsächlich mit dem VP-ITC gemessen. An einer Stelle fehlte eine ausreichende Samplemenge, und ich bin zu Professor Shirakawa in Kyoto gegangen, um ihr iTC200 zu leihen. Dieses zeigte, dass reduzierte Probemenge, schnelle Temperaturgleichgewichtung und kurze Messzeit von Vorteil waren. Aktuell arbeite ich mit dem PEAQ-ITC, der nach dem iTC200 veröffentlicht wurde. Jeder MicroCal ITC zeigt Vor- und Nachteile, aber die reduzierte Probemenge ist attraktiv. Bei kleinen Wärmemengen war das Fit manchmal unbefriedigend, und größere Konzentrationen wurden erforderlich. Dennoch, im Vergleich zum VP-ITC spart man Sample und beendet überraschend schnell die Gleichgewichtung und Messung. Zehn Messungen an einem Tag sind möglich, was beeindruckend ist.
Bei Aggregationsmessungen besteht der Nachteil, dass bei 1M NaCl-Titrationen hohe Verdünnungsenthalpien auftreten. Beim VP-ITC waren die Reaktionen übersteuert, aber beim PEAQ-ITC ist die geringe Titrationsmenge in der Lage, hohe Verdünnungsenthalpien zu quantifizieren. Die kurze Reaktionszeit erschwert die Aggregation und zeigt Vorteile beim Volumen. Specimens, die beim VP-ITC aggregierten, waren bei gleichen Bedingungen im PEAQ-ITC stabil und zeigten saubere Messungen.
Bei Amyloid-Fasern zeigte der PEAQ-ITC ordentliche Reaktionswärmen, aber unterscheidet sich stärker von VP-ITC in Hinsicht der Lag-Phase. Verschiedene ITC-Maschinen führen bei der Aggregation zu unterschiedlichen Sensitivitäten durch gegebenenfalls Rührungen oder Zelleneigenschaften.
Auch ermöglicht der PEAQ-ITC eine automatische, effektive Reinigung der Zelle und Spritze. Beim VP-ITC ist eine Reinigung wichtig, da Aggregationsmessungen bei unzureichender Säuberung zu geringeren Reproduzierbarkeiten führen. Aggregatsreste können Daten beeinflussen. Beim VP-ITC reinige ich manuell mit Detergenzien, bei hohen Temperaturen und hohen Rührgeschwindigkeiten, gefolgt von Zubehör-Reinigungen. Beim PEAQ-ITC genügt ein Klick für die Autowaschung. Nach Aggregationsmessungen empfehle ich das Soak-Feature mit Detergenzien und Erhitzen für die Säuberung. Auch ist der PEAQ-ITC sehr sensitiv für Fehlfunktionen, er zeigt Fehler bei geringer Reinigungsdurchflussmenge oder niedrigem Pumpendruck an, was die Reinigung verbessert.
 

4. Die Entwicklung von DSC aus Sicht der Anwender

Im Vergleich zu ITC hat sich die Entwicklung von DSC wenig verändert, aber bezüglich der Probenkonzentration gibt es Fortschritte. Jetzt mit VP-DSC gehen 0,1 mg/mL, aber in den 90er Jahren stand in den Artikeln, dass man 10 mg/mL Probenmasse benötigte. Die Empfindlichkeit des VP-DSC hat sich deutlich verbessert.
Für Bioanwendungen war es seit damals etwa 1 mg/mL. 10 mg/mL bezieht sich auf allgemeine DSC-Techniken. Diese messen Pulver oder Feststoffe in einer Pfanne, im Gegensatz zum Mikrocalorimeter. Der Unterschied zwischen DSC und Mikrokalorimeter ist, ob eine Messung in verdünnter wässriger Lösung erfolgen kann. Die Entwicklung für wässrige Messungen geschah durch Prof. Privalov (Johns Hopkins Univ.) mit DASM in den späten 1960er Jahren. In den 1970er Jahren erscheinen Artikel von ihm mit DASM. 1977 kam das erste MicroCal DSC System auf den Markt.
 
 Das VP-DSC wurde 1996 entwickelt, davor gab es Massen-Zellen. Die VP-Capillary DSC mit Kapillaren-Zelle kam erst im 21. Jahrhundert. Eigene Erfahrungen mit dem MC-2 zeigten hohen Probenverbrauch, mit ca. 1 mL Zellvolumen und bedurften minimum 1,5 mL. Konzentrationen von über 1 mg/mL waren nötig. Dieser DOSC-Standardbestand hatte gedauert, bis das VP-DSC erschien. Bis dahin war die Wärmemessung auf wenige Fachleute beschränkt, aber danach weit verbreitet.
Die handgefertigten Kalorimeter von früher wurden durch kommerziell hochwertige Produkte abgelöst, was die Verbreitung weiter vorantrieb. In den USA war bereits zuvor eine hohe Anerkennung vorhanden, aber in Japan begann es erst in den 1990ern zu verbreiten. Der große Anstieg kam mit der Einführung des VP-DSC.

5. Ist Kalorimetrie immer noch zu anspruchsvoll? Was genau ist der ΔCp?

Gute kommerzielle Kalorimeter haben zu mehr Messungen geführt, doch möglicherweise ist die Zahl der Interessierten mit Mut zur Anwendung gering. Spezialisierte Datensammlungen über Biomakromoleküle könnten helfen.
Vor etwa 15 Jahren erschien ein englisches Handbuch zur Stabilität von Proteinstrukturen (Literaturhinweis 3). In den darauffolgenden Jahren wurden Daten jedoch unzureichend zusammengestellt. Auch in den letzten 15 Jahren scheint die Erforschung der Wärmebeständigkeit mit DSC zurückzugehen. Globuläre Proteinforschung wechselte zu Misfolding und Aggregation oder anwendungsbezogenen Themen.
Bei DSC ist oft der Wunsch, Tm-Werte (Temperatur des gleichen Proteinanteils zwischen nativer und denaturierter Form) zu ermitteln hoch. Besonders Strukturanalytiker kombinieren DSC mit Strukturstabilitätsanalyse. Besonders zur Herstellung industrieller Proteine ist es wichtig, die thermische Stabilität zu kennen und idealerweise mit thermodynamischen Werten zu diskutieren, obwohl dies komplex ist. Auch ITC stößt auf Interesse, obwohl es gegenüber DSC mehr Probenmenge erfordert. Solange Unterschiede wahrgenommen werden können, genügen Tm und KD, doch Kalorimetrische Werte bieten vertiefte Einsichten. Viele kennen die zugrundeliegende Bedeutung nicht.
Der ΔCp beschreibt den Charakter von Proteinen. Ähnlich wie Menschen unterschiedliche Eigenschaften haben, unterscheiden sich Proteine durch den ΔCp-Wert. Proteine sind aus langkettigen Aminosäuren aufgebaut, die sich zu gefalteten, funktionellen Strukturen wandeln. Grundsätzlich meiden hydrophobe Aminosäuren Wasser, während hydrophile Aminosäuren wasserfreundlich sind, was zu Faltung führt. ΔCp steht in proportionaler Beziehung zur Anzahl hydrophober Reste. Viel Fett kann einen hohen ΔCp anzeigen.
Es gibt jedoch native Zustand Proteine, die sich nicht dreidimensional falten – sogenannte natürlich denaturierte Proteine. Sie haben wenige hydrophobe, aber viele hydrophile Reste. Anstelle einer gefalteten Proteinform bewegen sich natürlicherweise denaturierte Proteine fluktuierend in Lösungen. Ihre ΔCp-Werte könnten niedriger als die globulärer Proteine sein. Echter Forschungsbedarf besteht, ΔCp-Veränderungen nativer denaturierter Proteine mit DSC zu analysieren.
In meinen DSC-Messungen zur Ursache der Parkinson-Krankheit analysierte ich das native denaturierte Protein α-Synuclein. Bei erhöhter Temperatur zeigte es kein Denaturierungspeak, die Thermogramme zeigten keine Abweichung zum Basisniveau, was einen fast null ΔCp anzeigt. Da natürlich denaturierte Proteine über 30% der eukaryotischen Proteine ausmachen, werden Studien des ΔCp als relevantes Merkmal der Proteine fortgesetzt und genutzt, um zwischen globulären und native denaturierten Proteinen zu unterscheiden.
Es ist eine Herausforderung, physikalische Eigenschaften akkurat zu messen, besonders bei Proteinen. Ohne definitive Probensubstanz und -konzentration ist es schwierig, akkurate Werte festzustellen.
Wenn DSC-Messungen klar markierte Baselines zeigen, wäre das Ermitteln von ΔCp mittels Linien-Durchzug in Tm-Punkten eine Methode. Doch die Glaubwürdigkeit einer ΔCp-Messung einer einzelnen DSC-Abbildung ist eingeschränkt. Um akkurate Werte zu erzielen, sind DSC-Messungen bei verschiedenen Temperaturen und die Ableitung von Tm und Denaturierungs-ΔH zur Bestimmung des ΔCp vorzuziehen.
 
Ob es der echte ΔCp ist, kann auch dann unklar bleiben.
Das mag wahr sein und hängt von den „Annahmen“ ab. Nach meiner Meinung, wird die Denaturierung von Proteinen oft im Rahmen eines 2-Zustandsmodells beurteilt. Das ewige Problem ist aber, dass die Strukturen sowohl im nativem als auch im Denaturiertem Zustand temperaturempfindlich sind. Diese Unterschiede werden oft ignoriert und in einem 2-Zustandsmodell vereinfacht wiedergegeben. Insofern ist es fraglich, ob ein ermittelter ΔCp alleine wirklich den tatsächlichen Wert ausmacht. In Privalov’s Forschung wurden auch Temperaturabhängigkeiten nativer Zustände untersucht. Vielleicht war seine Absicht, Unterschiede in Nativen Strukturen hervorzuheben.

6. Bitte erklären Sie die Parameter, die ein Kalorimeter misst, verständlich!

Cp ist die Wärmekapazität bei konstantem Druck und gibt die Wärmemenge an, die benötigt wird, um die Temperatur eines Materials um ein Grad Celsius zu erhöhen. Ein hoher ΔCp bedeutet, dass viel Wärme erforderlich ist, um eine Temperaturänderung zu erreichen. In anderen Begriffen könnte man ΔCp als „Widerstandsfähigkeit gegen Hitzeaufnahme“ beschreiben.
Als Dozent für physikalische Chemie versuche ich, Studenten mit Analogien zu Wärmethermodynamikparametern wie Gibbs’schem Potential (G), Entropie (S), Enthalpie (H) aufzuklären. Studenten freuen sich oft über solche Vergleiche: Um ein Ziel zu erreichen, muss man G senken und ΔG negativ machen. Entropie ist das Streben nach Freiheit und Müßiggang, Energie/Enthalpie ist jedoch nötig, um energische Schritte zu erledigen. Ein Affinitätsvergleich mit partnerschaftlicher Harmonie vermittelt Verständnis für ΔG, ΔCp als Maß für Geduld, oder letzteres bei Witz auf jemandes Kosten, erfordert Mehrwärmefreisetzung, und deutet auf niedrigen ΔCp hin. Eine geduldige Person (hoher ΔCp) bleibt gelassen unter Stress.
Demnach, halte ich Prof. Fukada für eine sehr warme, geduldige Person mit hohem ΔCp.
Ob das nun ein Kompliment ist, weiß ich nicht… (lacht)
 
Viele sind durch die Begriffe Physikalische Chemie und Thermodynamik eingeschüchtert. Ich achte darauf, diese Begriffe anschaulich und verständlich zu präsentieren, was zu positiven Reaktionen von Studenten führt.
In Bezug auf ITC-Parameter: Affinitäten sind leicht zu verstehen, aber ΔH und ΔS sind schwierig zu interpretieren. ΔH beschreibt Interaktionen wie Wasserstoffbindung, während S die Bewegungsfreiheit widerspiegelt. Studierenden erkläre ich das Gleichwohl wie: Eine Bindung mit dominanter Wasserstoffbindung zeigt ein negatives ΔH (exotherme Reaktion, z.B. Händchenhalten – Erwärmung). S sinkt durch die Einengung (weniger Freiheit). Lebt jemand überwacht, erzeugt eine besondere Person eine Freiheit der Beobachter. Das beschreibt hydrophobe Anziehungsdomänen als Reaktion: ΔH könnte durch diese Interaktion positiv werden (Bindung der Überwachung – Energieerfordernd – Wärmesenkend – endotherme Reaktion) bei gleichzeitiger Steigerung von ΔS (Freisetzen der Überwachung – gesteigerte Unordnung).
Ja, wobei Änderungen in ΔH und ΔS oft Ausnahmecharakter haben: Viele Faktoren bestimmen den letztendlichen Beitrag. Für Einsteiger kann dies verstörend wirken. Deshalb sollte man, erst einmal die Grundlagen klären. Verstehen von bspw. KD, Der Bindungsrelevanz der Kapazität. Erst danach wird der Bindungsantrieb, darin liegende Bedeutung von ΔH und ΔS klarer. Eine mutierte Proteine kann gleiche Affinität und Zahl der Bindungen aufweisen, aber markant abweichende ΔH und ΔS-Werte zeigen, die die Bindungsart erhellend demonstrieren. Auch eine Analyse, die zeigt, dass zwei Bindungsstellen existieren, wäre damit möglich.

7. Was ist wichtig für vertrauenswürdige Daten?

Bei klarer Probensubstanz und -konzentration sind die Daten zuverlässig. Einzelwerte haben die Tendenz, unabhängig zitiert zu werden, weshalb es wichtig ist, nur belastbare Daten zu veröffentlichen. Als jemand, dem dies wichtig ist, messe ich so oft wie möglich, um konsistente Werte zu bestätigen.
Genau. Probenqualität steht an erster Stelle. Auch Wiederholbarkeit ist ausschlaggebend, ebenso wie der Vergleich mit anderen Methoden. ITC misst starke sowie schwache Bindungen, wohingegen Kristallisationsanalysen starke Bindungen priorisieren. Ein Verständnis dieser Unterschiede hilft bei der Reproduzierbarkeit. Dass schwächere Wechselwirkungen von ITC nicht in Kristallanalysen erkannt werden, ist kein Wunder. Beim Kristallisieren verwendete PEG u.Ä. bewirken möglicherweise „Molekülcrowder“-Effekte, die molekulare Bindungen fördern. Solche Effekte mit ITC bei Crowder-Zugabe zu messen, könnte ratsam sein.
Das Augenmerk auf saubere Cell setzt sich konsequent fort. Nach jeder Messung verwende ich Detergenzien zur Reinigung. Eine Ruhelage von Cell für eine begrenzte Zeit ist ausreichend. Schmutzige Cells verursachen Störsignale und sollten keinen Grund darstellen.
Ja. Studierende instruieren wir gründlich zur Reinigung von Cells und Spritzen. Notizen während der Messung sind ebenfalls entscheidend, um gewöhnliche der Baselines und DP-Werte festzuhalten. Sollte ein ungewöhnlich Wert erscheinen, kann man so den Zustand des Systems beurteilen. Fehlerhafte Systeme liefern unzuverlässige Ergebnisse.

8. Welche Literatur ist hilfreich bei der Dateninterpretation?

Wenn es um DSC und ITC in der Thermodynamik geht, wird oft auf Sturtevant (Yale Univ.), Privalov, Cooper (Glasgow Univ.), Freire (Johns Hopkins Univ.) und Ladbury (Univ. of Leeds) verwiesen. Ein Klassiker von Sturtevant (1977) ist nicht weniger als ein Bibelgleiches Werk. Kapitel zur Entropie, Wärme und die Wärmekapazität beschäftigen auch heutige Forscher. Lesen lohnt sich besonders, wenn man schon etwas Kalorimetrie studiert hat.
Stimmt. Wenn man versucht, die Interpretation der Daten zu verbessern, sollte man nachschlagen.
Ein Überblick meiner Vorlesung für Malvern (Juni 2016) enthält eine hilfreiche Literaturliste.
 
 Nature Protocols listet zwei ITC-Publikationen (Literaturhinweis 5, 6). Sie beschreiben Mess-, Analyseverfahren und Vorbereitungsdetails zu Proben klarverständlich. Freire war der erste, der darüber publizierte. Ein Editing von Ladbury’s Biocalorimetry 2 wurde 2004 veröffentlicht, mittlerweile wäre eine dritte Ausgabe wünschenswert.
 
 Es bleibt wichtig, benutzerfreundliche Sachbücher für Neulinge zu schaffen. Ich habe einen bereitstellen Artikel zur Interpretation und Datenanalyse in Verbindung mit thermodynamischen Strukturen, der nützlich sein könnte (Literaturhinweis 6). Darin wird auch Konformationsentropie diskutiert. Eine gute Lektüre bieten die im Malvern-Blog veröffentlichten „Kalorimeter-Meister-auf-dem-Weg“ Artikel.

9. Welche Messungen möchten Sie in Zukunft machen?

Es gibt viele Anwendungsmöglichkeiten für ITC bei einem kreativen Ansatz. Ich plane eine Reihe von Experimenten damit zu führen, einschließlich Protein-Faltung. Beispielsweise könnte man pH-Änderungs- oder Lösungsmittelbedingungen verwenden, um die Wärmemessung beim Faltungsprozess zu beobachten. Eine Peptonlösung könnte alkalisiert werden, um die Faltung direkt zu beobachten. So betrachtet, wäre die Reaktion entgegensetzt bei DSC, welches bei Denaturierung Erhitzungsergebnisse ermittelt. Ein eine Alternative dazu ist ein System, das ein Enzym zur Initiation der Faltung nutzt. Indem man dieses Enzym graduell titriert, könnte die gemessene Wärme die Faltung aufzeichnen. Spannend ist auch die ITC-vermittelte Untersuchung der Aggregation, speziell die Entwicklung von Assays zur Unterdrückung krankheitsauslösender Proteinaggregate. Demnächst präsentiere ich das in einem Malvern-Webinar.
klingt spannend.
Vor kurzem habe ich E. coli mit DSC gemessen.
Vor über zehn Jahren habe ich einmal Hefe dafür gemessen; ein Wärmeschock bewirkte aufregende Peaks.
Beeindruckend! Ein Peptid, das E. coli toxische Wirkung hat und die Membran angreift, hat in der Messung bei niedriger Temperatur Peaks gezeigt. Ähnliches wurde publiziert, allerdings mit weniger überzeugender Datenreproduktion. Zukünftige Versuche wären daher spannend.
Reproduzierbarkeit solcher Bakterienmessungen ist zu beurteilen. Zellwachstumsphasen beeinflussen ebenfalls. Trotz präziser Wiederholung entstehen häufig unterschiedliche Signale. Lebewesen erweisen sich als herausfordernd.
Mit ITC ist Enzymreaktionsanalyse a la Michaelis-Menten möglich. Das Interesse an Austauschkonstanten (kon und koff), veröffentlicht von einem spanischen Team kürzlich, zieht an. Diese ITC-Fortschritte sind erfreulich.
Ergänzende Anwendungsnotizen stehen zum Download.
Enzymmessungen

Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten

In Spanien legt man Wert auf kinetische Analysen. Auch DSC legte früher wert darauf, irreversible Denaturierung kritisierte.
Im Gegensatz zu ITC-Reaktionen ermöglicht DSC kinetische Analysen. Thermische Denaturierung macht Aggregation unvermeidlich und damit irreversibel. Fit an den Lumry-Eyring-Modellansatz ermöglicht kinetische Analysen. Diese Technik ist nicht verbreitet, doch wir praktizieren es ebenfalls. Sofern man ein geeignetes Modell konstruiert, ließen sich auch andere Prozesse analysieren.
Bezüglich Geschwindigkeitskonstanten, welche Reaktionsgeschwindigkeiten sind messbar?
Wahrscheinlich mit Zeiten im Sekundenbereich – schneller wohl nicht. Kinetische Konstanten könnten in unterschiedlichen Temperaturen zur Bestimmung von Aktivierungsenergien führen, was wiederum die Erstellung umfangreicher Reaktionsenergielandschaften ermöglicht.
Binding von Liganden verläuft meist schneller, wenig fall-bezogen im Sekundenbereich, aber bei ausgedehnten Reaktionen, lassen sich voraussichtlich kinetische Analysen durchführen.
 

【Abschließende Anmerkungen】

Ein Jahr und sechs Monate unserer Reihe „Der Weg zum Kalorimeter-Meister“ schließen mit einem Interview von Professor Fukada der Universität Osaka Prefecture und Professor Lee von der Universität Osaka. In den Beiträgen wurde bemüht, Kalorimeter einem breiteren Publikum näher zu bringen. War es Ihnen hilfreich?
Diesmal haben die Professoren tiefergehende Informationen zur Interpretation der Messparameter bereit gestellt und konkretisiert, was sich aus Lehrbüchern entziehen könnte. Auf diesem Weg hoffen wir, unterstützt durch die Expertise in diesem Blog von Professor Fukada und den Beitrag von Professor Lee im Webinar, wertvolle Dienstleistungen für Ihre Forschung von Malvern anzubieten.
Literaturliste mit Referenzen, erwähnt im Text, steht im folgenden „Downloadbutton“ bereit.

Download

Zurückliegende Artikel des Kalorimeter-Meisterwegs

Dieser Artikel wurde möglicherweise automatisch übersetzt