Wie funktioniert Multi-Detektor-GPC/SEC?

von Kyle Williams, Thursday, 20th June 2019

Egal, ob Ihre Proben synthetische Polymere, natürliche Materialien wie Polysaccharide oder Proteine, Antikörper oder andere biologische Proben sind, Gelpereationschromatographie / Größenausschlusschromatographie (GPC/SEC) ist die ideale Technik zur Charakterisierung dieser und anderer Makromoleküle. Die aus der GPC/SEC-Analyse gewonnenen Informationen umfassen das Molekulargewicht (MW), die Molekülgröße in Form von hydrodynamischem Radius (Rh) und Gyrationsradius (Rg), die intrinsische Viskosität (IV), die Konzentration, Kompositionsanalyse und Verzweigungsdaten sowie andere Parameter. Die verfügbaren Daten hängen von der vorhandenen Detektorkombination ab, da verschiedene Detektoren kombiniert werden, um verschiedene Teile des Charakterisierungspuzzles anzubieten. Dieser Post wird aufzeigen, wie die verschiedenen Detektoren, die auf den OMNISEC und Viscotek TDA Plattformen verfügbar sind, zusammenarbeiten, um eine umfassende Charakterisierung einer Probe zu bieten. Für weitere Details (und Gleichungen!) Sehen Sie sich bitte unser White Paper zu den Prinzipien der Multi-Detektor-GPC/SEC an.

Die Beziehungen zwischen Detektor und Molekülparametern sind oben in der Grafik zusammengefasst. Die Grafik beginnt unten mit dem vom jeweiligen Detektor direkt gemessenen Probenattribut, bewegt sich dann zu den Werten, die direkt aus den beobachteten Detektorantworten berechnet werden, und endet oben mit Informationen, die aus den direkt berechneten Daten errechnet werden.

Die vier Detektoren, die am häufigsten mit einem vollständig ausgestatteten Multi-Detektor-GPC/SEC-System verbunden sind, sind ein Differenzial-Refraktionsindex-(RI)-Detektor, ein Lichtstreudetektor (RALS/LALS oder MALS), ein differenzieller Viskosimeter-Detektor und ein UV-Detektor. Das spezifische Merkmal einer Probe, auf das diese Detektoren ansprechen, ist in der untersten Reihe der obigen Abbildung aufgeführt. Der RI-Detektor reagiert auf die Änderung des Brechungsindex zwischen der Probenlösung und dem blanken Lösungsmittel. Der Lichtstreudetektor spricht am stärksten auf das Molekulargewicht der Probe an, wobei Proben mit höherem Molekulargewicht eine intensivere Reaktion hervorrufen. Das Signal des differenziellen Viskometer-Detektors basiert auf dem Unterschied in der Lösungsmittelviskosität der Probenlösung im Vergleich zum blanken Lösungsmittel. Und die Reaktion des UV-Detektors basiert auf dem Absorptionsniveau der Probe. Eine Probe ohne Chromophor, die kein UV-Licht absorbiert, erzeugt kein UV-Signal.

Alle GPC/SEC-Systeme müssen mindestens einen Konzentrationsdetektor haben, unabhängig davon, welche anderen Detektoren vorhanden sind. Die RI- und UV-Detektoren werden als Konzentrationsdetektoren betrachtet, da ihre Antworten direkt proportional zur Probenkonzentration sind. Die meisten Systeme verwenden einen RI-Detektor, da nicht alle Proben UV-aktiv sind. Mit Kenntnis des dn/dc-Werts oder des Brechungsindexzuwachses einer Probe kann die genaue Konzentration einer Probe bei jedem Datenschnitt aus dem RI-Detektor berechnet werden. Ebenso, wenn ein UV-Detektor verwendet wird, die Kenntnis des dA/dc-Werts, der mit seinem molaren Extinktionskoeffizienten in Verbindung steht, ermöglicht die Berechnung der Probenkonzentration bei jedem Datenschnitt. Mit beiden, RI- und UV-Detektoren, kann die Zusammensetzung einer Probe, die aus zwei Komponenten besteht, bestimmt werden.

Die genaue Konzentration der Probe bei jedem erfassten Datenschnitt zu kennen, ist entscheidend, da sie notwendig ist, um das Molekulargewicht und die intrinsische Viskosität zu bestimmen, zwei der herausragenden Molekülparameter, die im direkt berechneten mittleren Abschnitt der vorherigen Hierarchiefigur enthalten sind. Eine Untersuchung der oben aufgeführten Gleichungen, die die Detektorantworten regieren, zeigt, warum die Konzentration der Probe von entscheidender Bedeutung ist. Konzentriert man sich auf die Lichtstreuungsgleichung, so ist die Detektorausgabe beobachtet, das KLS repräsentiert die Detektorkonstante, die durch Analyse eines schmalen Standards erhalten wurde, das Molekulargewicht ist unbekannt, der dn/dc-Wert ist bekannt, da er in der Gleichung für den RI-Detektor verwendet wird, um die Konzentration zu berechnen, die dann in die Lichtstreuungsgleichung eingespeist wird, und das Injektionsvolumen ist bekannt, da es vom Benutzer festgelegt wird. Das lässt das Molekulargewicht als die einzige unbekannte Größe. Durch die Kombination von RI- und Lichtstreudetektoren kann das Molekulargewicht einer Probe bei jedem Datenschnitt berechnet werden. Die berechneten Molekulargewichte werden dann über den definierten Probenpeak integriert und die Molekulargewichtsmomente basieren auf den relativen Konzentrationen jeder Fraktion berechnet.

Ein analoger Prozess erfolgt mit den RI- und Viskosimeter-Detektoren, um die IV der Probe bei jedem Datenschnitt direkt zu berechnen und einen gewichtsbedingten IV-Wert zu erzeugen.

Vom im mittleren Bereich direkt berechneten Daten ausgehend, zeigt die oberste Ebene der Hierarchiefigur, dass das Molekulargewicht und die IV einer Probe kombiniert werden können, um indirekt Parameter zu berechnen, die Einblick in die Molekülstruktur der Probe bieten.

Die Größe einer Probe steht typischerweise nur an zweiter Stelle hinter dem Molekulargewicht hinsichtlich der häufig gesuchten Charakterisierungsdaten, und Rh ist der Größenparameter, der für alle Probentypen am besten geeignet ist. Es sei darauf hingewiesen, dass Rg aus einem Lichtstreudetektor mit mindestens zwei Winkeln und einem Konzentrationsdetektor berechnet werden kann (daher seine Platzierung in der mittleren Ebene), allerdings muss die Probe groß genug sein, um Winkelabhängigkeit zu zeigen. Viele Proben, einschließlich Proteine, sind nicht groß genug, um dies zu tun, und daher kann Rg für diese Proben nicht berechnet werden. Im Gegensatz dazu kann Rh berechnet werden, solange ausreichende Daten von einem Konzentrationsdetektor, einem Lichtstreudetektor und einem Viskosimeter-Detektor vorhanden sind, um Molekulargewicht und IV-Daten zu generieren. Rh repräsentiert den Radius der theoretischen Kugel, die von einer Probe mit dem berechneten Molekulargewicht und der IV besetzt wurde. Da IV in Bezug auf dL/g oder Volumen geteilt durch Masse beschrieben wird, kann es mit dem Massenbegriff des Molekulargewichts kombiniert werden, um ein theoretisches Volumen für die Probe zu berechnen. Ein sphärisches Modell basierend auf (4/3)πr3 wird angewandt, um r zu bestimmen, das letztendlich das Rh der Probe ist.

Die Mark-Houwink-(MH)-Parameter werden aus dem MH-Plot berechnet, der die IV der Probe gegen ihr Molekulargewicht darstellt, um eine visuelle Darstellung der Beziehung zwischen den beiden zu bieten. Diese MH-Plots verwenden Daten, die von drei Detektoren (Konzentrations-, Lichtstreu- und Viskosimeter) erworben wurden, und können Änderungen in der Molekülstruktur innerhalb einer einzelnen Probe oder Unterschiede zwischen mehreren Proben hervorheben. Ein häufiger Gebrauch dieser Plots ist es, den Grad der Verzweigung innerhalb einer Probenverteilung zu identifizieren und zu quantifizieren.

Die Multi-Detektor-GPC/SEC-Analyse bietet eine Reihe von Charakterisierungsdaten zu verschiedenen Aspekten einer Probe, indem sie eine Reihe von Detektoren einsetzt, die unterschiedliche Molekülparameter messen. Mit einem kompletten Satz von Detektoren, die im Einklang arbeiten, ist das Ergebnis eine Sammlung von Daten, die weitaus mehr bietet, als ein Einzeldetektorsystem zugänglich machen würde. Durch die direkten Messungen der einzelnen Detektoren können bestimmte Parameter direkt berechnet werden. Und daraus kann die Software weitere indirekt berechnete Daten gewinnen und so Informationen bereitstellen, die strukturellen Einblick in die Probe bieten. All dies aus einer einzigen Injektion Ihrer Probe!

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