Rh oder Rg: Was ist das Beste für meine GPC/SEC-Proben?
Das Hauptziel bei der Anwendung von Gelpermeationschromatographie / Größenausschlusschromatographie (GPC/SEC) ist oft die Bestimmung des Molekulargewichts einer makromolekularen Probe. Multidetektor-Systeme, wie z.B. die OMNISEC und TDAmax Systeme von Malvern Panalytical, können eine Vielzahl von anderen molekularen Charakterisierungsparametern anbieten, einschließlich der Molekülgröße. In einigen Situationen, wie z.B. der Analyse von Proteinen oder anderen Proben, bei denen das Molekulargewicht bereits bekannt ist, besteht der einzig Zweck der Analyse darin, die Molekülgröße der Probe zu bestimmen. In diesen Fällen kann die Molekülgröße entscheidende Informationen über die molekulare Struktur der Probe offenbaren, die oft eng mit der endgültigen Funktion oder Anwendung der Probe verknüpft ist.
Es gibt zwei gebräuchliche Messungen der Molekülgröße, die durch die GPC/SEC-Analyse verfügbar sind: der hydrodynamische Radius (Rh) und der Gyrationsradius (Rg). Ein vorheriger Beitrag beschreibt, wie Rh und Rg für die Charakterisierung von Proteinen mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) und kleinwinkeliger Röntgenstreuung (SAXS) genutzt werden. Dieser Beitrag wird die Definitionen von Rh und Rg, deren Berechnung im GPC/SEC-Kontext und die praktischen Auswirkungen dieser Unterschiede diskutieren. Für weitere Details (und mehr Gleichungen!) zu den hier behandelten Themen siehe bitte diese verlinkten Dokumente.
Definitionen von Rh und Rg
Ohne zu sehr in die Mathematik einzutauchen (noch nicht), stellt der Rh eines Musters den Radius einer theoretischen Kugel dar, die dieselbe Masse und Dichte besitzt, wie sie für die Probe aus ihrem Molekulargewicht und der intrinsischen Viskosität berechnet wird. Der Rg repräsentiert die Wurzel aus dem mittleren Quadratabstand der Bestandteile des Moleküls vom Massenschwerpunkt des Moleküls. Die einzelnen Rh- und Rg-Werte, die durch eine GPC/SEC-Analyse erzeugt werden, sind die gewichteten Durchschnittswerte, die durch das Zusammenstellen der berechneten Werte in jedem Datenschnitt gewonnen werden. Ähnlich dem gewichteten durchschnittlichen Molekulargewicht (Mw) sind diese Werte am besten geeignet, um das gesamte Muster zu charakterisieren. Es sollte beachtet werden, dass ein Multiwinkel-Lichtstreudetektor (MALS), der von einem in der Batch-Modus betriebenen GPC/SEC-Instrument entkoppelt ist, den z-Durchschnitts-Rg-Wert, Rgz, liefert.
Wie Rh und Rg berechnet werden
Nun werden wir uns ein wenig der Mathematik widmen. Basierend auf Einsteins Modell zur Beschreibung der Viskosität einer Lösung von kugelförmigen Partikeln zeigt die Beziehung zwischen Rh, Molekulargewicht (M) und intrinsischer Viskosität ([η]) die folgende Formel (NA ist die Avogadro-Zahl).
Da GPC/SEC Molekulargewicht und intrinsische Viskosität direkt für jeden Datenschnitt berechnet, kann der Rh leicht mit dieser Gleichung bestimmt werden. Daher stimmt die untere Grenze für die Rh-Berechnung mit der kleinsten Probenfraktion überein, für die ausreichend Detektorantwort in den Brechungsindex (RI)-, Lichtstreu- und Viskosimeterkanälen vorhanden ist.
Für die Berechnung von Rg aus GPC/SEC gibt es zwei Optionen. Die direkte und häufigste Methode besteht darin, die Änderung der Lichtstreuintensität gegenüber dem Beobachtungswinkel zu beobachten. Dies erfordert einen Lichtstreudetektor mit mindestens zwei Winkeln, um die Winkeldependenz der Probe zu beobachten.
Wie in der vorangegangenen Diskussion über Rh und Rg und in einem neueren Beitrag zu Lichtstreudetektoren erwähnt, ist es schwierig, Rg für Proteine mit GPC/SEC zu bestimmen, da Proteine im Allgemeinen kleiner als 10-15 nm sind und daher isotrope Streuer sind, d.h. sie streuen das Licht gleichmäßig in alle Richtungen. Niedermolekulare Polymere sind ebenfalls isotrope Streuer, was bedeutet, dass der daraus resultierende partielle Zimm-Plot flach ist und einen Neigungswert von null aufweist, weshalb Rg für diese kleineren Materialien nicht bestimmt werden kann. Dies ist in Abbildung 1 links dargestellt.
Damit Rg durch Lichtstreuung berechnet werden kann, muss das Molekül Winkelabhängigkeit zeigen, was bedeutet, dass die Intensität des gestreuten Lichts mit dem Beobachtungswinkel variiert. Dies resultiert in einem geneigten teilweisen Zimm-Plot, wie im Beispiel auf der rechten Seite in Abbildung 1 gezeigt. Die Wellenlänge des Lichts, die im Lichtstreudetektor verwendet wird, beeinflusst die Größenschwelle, bei der eine Probe Winkelabhängigkeit zeigt, sodass es möglich ist, dass Rg auf kleinere Größenbereiche berechnet werden kann, indem die Wellenlänge der Lichtquelle angepasst wird.
Eine alternative Möglichkeit zur Berechnung von Rg ist die Verwendung der Flory-Fox-Gleichung, die im Folgenden gezeigt wird und das Molekulargewicht (M) und die intrinsische Viskosität ([η]) mit Rg in Beziehung setzt (Φ0 wird als Konstante behandelt).
Der Vorteil, Rg auf diese Weise zu berechnen, besteht darin, dass, ähnlich wie oben bei Rh, die untere Grenze der Berechnung von der Detektorantwort abhängt, statt davon, ob die Probe Winkelabhängigkeit zeigt. Der Nachteil ist, dass der Begriff Φ0 tatsächlich von der Probe, dem Lösungsmittel und der resultierenden molekularen Struktur unter Untersuchung abhängt (am besten geeignet für zufällige Knäuel) und daher das Festlegen als Konstante einen gewissen Grad an Näherung einführt. Allgemein, und für den Rest dieses Beitrags, wenn Rg diskutiert wird, wird es aus einem Lichtstreudetektor berechnet.
Unterschiede in den Rh- und Rg-Daten
Die verfügbaren Rh- und Rg-Daten einer gegebenen Analyse hängen von der spezifischen Probe ab, die untersucht wird. Da die Berechnung von Rg erfordert, dass ein Molekül Winkelabhängigkeit zeigt, besteht die Möglichkeit, dass Rg nicht bestimmt werden kann, wenn eine Probe ein isotroper Streuer ist, der keine Winkelabhängigkeit zeigt. Eine Probe mit einer breiten Verteilung des Molekulargewichts und der Molekülgröße könnte große Fraktionen aufweisen, die Winkelabhängigkeit zeigen, sowie kleinere Fraktionen, die dies nicht tun. In diesem Fall kann Rg nur für die früher eluierenden, größeren Moleküle berechnet werden.
Ein Beispiel für dieses Verhalten ist in Abbildung 2 gezeigt. Die Abschnitte der Daten, in denen die Rh- und Rg-Werte direkt berechnet werden, sind durch die durchgezogenen Segmente der dunkelgrünen und magentafarbenen Plots dargestellt. Die gestrichelten Linienabschnitte zeigen Bereiche, in denen die Rh- und Rg-Werte extrapoliert werden. Der kleinste Rg-Wert, der für die Probe berechnet werden kann, beträgt 11,55 nm, was den Punkt repräsentiert, an dem die später eluierenden Fraktionen der Probe zu klein sind, um Winkelabhängigkeit zu zeigen. Dies führt dazu, dass für einen großen Teil der Probe Rg extrapoliert werden muss. Im Gegensatz dazu kann Rh bis zu 5,08 nm berechnet werden, was die direkte Berechnung der Molekülgröße für den Großteil der Probe ermöglicht.
Da Rh und Rg unterschiedliche Eigenschaften der Probe darstellen, sollte nicht erwartet werden, dass die resultierenden Werte gleich sind. Das bedeutet nicht, dass einer von ihnen falsch ist! Für einen bestimmten Probentyp und ein bestimmtes Lösungsmittel wird wahrscheinlich eine konsistente Beziehung zwischen den beiden bestehen. Nach meiner Erfahrung mit polymeren Proben (da es schwierig ist, Rg-Daten für Proteine zu erhalten) ist der berechnete Rg im gleichen Bereich, aber etwas größer als der bestimmte Rh (im Beispiel in Abbildung 2 Rh = 13,62 nm; Rg = 14,19 nm). Dies muss nicht in allen Fällen zutreffen, da die Beziehung zwischen Rh und Rg von der molekularen Struktur abhängt.
Die Molekülgröße ist für Wissenschaftler aus einer Vielzahl von Gründen wichtig. Ich ermutige Sie, die verfügbaren Daten auf die für Ihre Proben am besten geeignete Weise zu verwenden. Und das nächste Mal, wenn Sie GPC/SEC-Daten präsentieren und jemand nach den Unterschieden zwischen Rh und Rg fragt, werden Sie vorbereitet sein!
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