Thermisches Entfalten von Proteinen: Prinzipien, Methoden und Anwendungen – Was ist thermisches Entfalten?

Thermisches Entfalten ist der temperaturbedingte Verlust der nativen dreidimensionalen Struktur eines Proteins. Mit zunehmender thermischer Energie werden nicht-kovalente Wechselwirkungen, die den gefalteten Zustand stabilisieren — Wasserstoffbrücken, hydrophobe Packung, van-der-Waals-Kontakte — schrittweise gestört, und das Protein geht von einer geordneten, kompakten Konformation in einen ungeordneten oder teilweise strukturierten Zustand über.

Dieser Übergang wird typischerweise durch die Schmelztemperatur (T_m) charakterisiert: die Temperatur, bei der gefaltete und entfaltete Populationen in gleichem Verhältnis vorliegen. T_m ist keine feste physikalische Konstante eines Proteins für sich genommen — sie hängt von den Lösungsbedingungen, der Pufferzusammensetzung und dem Vorhandensein von Liganden oder Hilfsstoffen ab — und genau das macht sie so nützlich. Der Vergleich von T_m über Bedingungen oder Varianten hinweg liefert ein quantitatives, reproduzierbares Maß für die relative thermische Stabilität. Diese Abhängigkeit vom Kontext reicht über das Reagenzglas hinaus: Die zellweite Thermal-Profilling-Studie von Leuenberger und Kollegen, die das Entfalten von Tausenden von Proteinen gleichzeitig in intakten Zellen verfolgte, zeigte, dass die Thermostabilität mit strukturellen und biologischen Eigenschaften wie Proteingröße, Quartärstruktur und Aggregationsneigung korreliert, statt allein durch die Aminosäuresequenz bestimmt zu werden.¹ Thermische Stabilität spiegelt also den umfassenderen strukturellen Kontext eines Proteins wider, nicht nur seine Faltung isoliert — und unterstreicht damit, warum eine in vitro gemessene Tm-Verschiebung ein so informativer, allgemein übertragbarer Indikator für die zugrunde liegende strukturelle Empfindlichkeit ist.

Eine höhere T_m bedeutet im Allgemeinen ein thermisch stabileres Molekül, und T_m-Verschiebungen gehören zu den schnellsten Möglichkeiten zu erkennen, wie sich eine Mutation, ein Puffer, ein Hilfsstoff oder eine Formulierungsbedingung auf die Stabilität eines Proteins auswirkt.

In der biopharmazeutischen Entwicklung ist das wichtig, weil thermische Stabilität eng mit dem Verhalten eines Proteins unter realen Belastungen korreliert: erhöhte Temperatur während Herstellung, Transport oder Lagerung; Freeze-Thaw-Zyklen; oder einfach die Verweilzeit bei Temperatur während der Haltbarkeit. Eine niedrigere oder verschobene Tm ist ein früher Hinweis darauf, dass ein Molekül für diese Belastungen anfälliger sein könnte.

Das Entfalten ist auch mechanistisch mit nachgelagerten Risiken verknüpft. Wenn ein Protein seine native Struktur verliert, werden zuvor verborgene hydrophobe Reste dem Lösungsmittel ausgesetzt. Diese exponierten Oberflächen sind der Haupttreiber von Protein-Protein-Assoziation, wodurch teilweise oder vollständig entfaltete Spezies zur Aggregation neigen. Aggregation wiederum ist mit dem Verlust biologischer Aktivität, veränderter Pharmakokinetik und — bei Biologika — mit einem Risiko der Immunogenität verbunden. Thermisches Entfalten ist daher selten für sich genommen von Interesse; es ist ein Surrogat für die strukturelle Instabilität, die diesen nachgelagerten Ausfallmodi vorausgeht, weshalb Llowarch et al. den thermischen Shift als einen der empfindlichsten und am weitesten verbreiteten Indikatoren für die Protein-Stabilität in der frühen Wirkstoffforschung beschreiben.²

Wie wird thermisches Entfalten gemessen?

Differential Scanning Calorimetry (DSC) und Differential Scanning Fluorimetry (DSF) sind die beiden am häufigsten verwendeten Techniken zur Messung des thermischen Entfaltens und erfassen grundsätzlich unterschiedliche physikalische Eigenschaften.

DSC misst die Wärme direkt. Entfaltung ist ein endothermer Prozess, weshalb sie als Wärmekapazitäts-Peak erscheint, aus dem T_m, die Enthalpie des Entfaltens (ΔH) und die Änderung der Wärmekapazität (ΔC_p) abgeleitet werden können, ohne auf ein Reporter-Molekül oder ein angenommenes spektroskopisches Modell angewiesen zu sein. Das macht DSC zu einer modellunabhängigen, thermodynamisch direkten Messung — der Referenztechnik, an der andere Methoden typischerweise validiert werden.

DSF ist optisch und indirekt: Es verfolgt ein Fluoreszenzsignal, das sich beim Verlust der Struktur verändert. Konventionelles DSF verwendet einen extrinsischen Farbstoff, der beim Entfalten an exponierte hydrophobe Oberflächen bindet. Intrinsisches DSF als vollständig markierungsfreie Technik verfolgt die intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan- und Tyrosinresten, während das Protein erhitzt wird. Wenn diese Reste beim Entfalten stärker dem Lösungsmittel ausgesetzt werden, verschiebt sich ihr Emissionsspektrum, und die Auftragung dieser Verschiebung gegen die Temperatur zeigt die Onset-Temperatur und die T_m.

Beide Methoden sind nicht austauschbar. Ein direkter Vergleich des NIST ergab, dass DSC- und DSF-T_m-Werte oft übereinstimmen, aber nicht immer. Die Ergebnisse hängen von der Scan-Rate ab, und die Wahl der Methode kann die ermittelten Übergangstemperaturen deutlich verschieben — eine Erinnerung daran, dass „wie man misst“ ebenso wichtig ist wie „was man misst“³, da das Entfalten häufig kinetisch und nicht rein thermodynamisch kontrolliert ist.³

Deshalb sind die Techniken komplementär und nicht austauschbar: DSC liefert thermodynamische Tiefe, DSF liefert hohen Durchsatz. Der Einsatz von DSF für ein breites frühes Screening und von DSC zur Bestätigung und Charakterisierung der resultierenden Treffer kompensiert die Haupteinschränkung jeder Methode — ganz entsprechend der aktuellen Praxis in der Wirkstoffforschung, in der Shift-Assays als Primärscreen und kalorimetrische Methoden als orthogonale Bestätigung dienen.² DSC und DSF geben Auskunft über die Konformation, nicht darüber, was passiert, sobald ein Protein zu entfalten beginnt. Dynamische Lichtstreuung (DLS) schließt diese Lücke: DLS misst die Größe von Partikeln in Lösung, indem die Fluktuationen des gestreuten Lichts analysiert werden, und ist dadurch äußerst empfindlich für das Auftreten höherer Spezies — Dimere, Oligomere und größere Aggregate — wenn eine Probe erhitzt wird. Wird SLS als thermischer Rampentest zusammen mit DSF oder DSC durchgeführt, zeigt es den Beginn der Aggregation (T_agg) sowie alle durch DLS erfassten Änderungen des hydrodynamischen Radius auf und macht sichtbar, ob auf ein Entfaltungsereignis eine Selbstassoziation folgt.

DLS und SLS: das Gesamtbild vervollständigen

Statische Lichtstreuung (SLS) ergänzt eine weitere thermodynamische Ebene. Aus der Konzentrationsabhängigkeit der Streuintensität liefert SLS direkten Zugang zum zweiten Virialkoeffizienten, B₂₂ — ein Maß für die Netto-Protein-Protein-Wechselwirkung. Dies ist ein belastbarerer Messwert als der Diffusions-Wechselwirkungsparameter, k_D, der traditionell allein aus DLS abgeleitet wird: k_D ist empirisch und vermischt die tatsächliche thermodynamische Wechselwirkung mit hydrodynamischen und Reibungseffekten, was manchmal das scheinbare Vorzeichen der Wechselwirkung verfälscht oder sogar umkehrt. B₂₂ ist frei von diesen hydrodynamischen Artefakten und daher ein direkterer und zuverlässigerer Prädiktor für kolloidale Stabilität, Löslichkeit und Aggregationsneigung.

Zusammen ergeben eine Konformationsanalyse (DSF oder DSC), eine Größanalyse (DLS) und eine thermodynamische Wechselwirkungsanalyse (SLS) aus einem einzigen thermischen Scan ein vollständiges Bild — nicht nur, wann ein Protein entfaltet, sondern ob, wie stark und unter welchen Bedingungen es anschließend Selbstassoziation eingeht.

Warum DSF und hochdurchsatzfähiges DLS/SLS kombinieren?

Entfalten und Aggregation hängen zusammen, sind aber nicht dasselbe Ereignis, und sie verlaufen nicht immer parallel. Ein Molekül kann konformationell sehr stabil sein und dennoch bei moderaten Temperaturen aufgrund kolloidaler Instabilität aggregieren; umgekehrt kann ein Molekül bei einer relativ niedrigen T_m entfalten, ohne sofort sichtbare Aggregate zu bilden. Misst man nur eines von beiden, besteht das Risiko, den jeweils anderen Ausfallmodus vollständig zu übersehen.

Genau das wird in der Wirkstoffforschungsliteratur zu Thermal-Shift-Ansätzen hervorgehoben: Da diese Assays auf der einfachen physikalischen Verknüpfung zwischen Temperatur und dem gefaltet/entfaltet-Gleichgewicht eines Proteins beruhen, sind sie am aussagekräftigsten, wenn sie mit orthogonalen Nachweismethoden kombiniert werden, die bestätigen, was dieses verschobene Gleichgewicht tatsächlich mit der Probe macht.⁴ Wenn DSF und DLS/SLS auf demselben thermischen Rampenverlauf, auf derselben Platte, durchgeführt werden, kann jeder T_m-Wert anhand eines T_agg-Werts aus derselben Probe und demselben Heizprofil überprüft werden — kein zweites Experiment, kein separates Aliquot, kein Risiko, dass Unterschiede zwischen Assays in Wirklichkeit nur Unterschiede zwischen Probenvorbereitungen sind.

Auch der Effizienzgewinn ist ebenso überzeugend wie der wissenschaftliche Nutzen. Statt eine DSC-Kampagne, einen separaten DSF-Screen und anschließend eine DLS/SLS-Stabilitätsstudie durchzuführen, erfasst ein kombinierter DSF/DLS/SLS-Workflow konformationelle und kolloidale Daten in einem Durchgang. Für Formulierungs-Screening und Stabilitätsbewertung — wenn Dutzende von Puffer-, pH- und Hilfsstoffkombinationen verglichen werden müssen — spart diese Integration sowohl Probe als auch Zeit, ohne Tiefe und Qualität des Datensatzes zu beeinträchtigen.

Vorteile der Hochdurchsatzanalyse

Hochdurchsatz bedeutet nicht nur Geschwindigkeit um ihrer selbst willen; er verändert die Art der Fragen, die man stellen kann. Ein plattenbasierter, hochdurchsatzfähiger DSF/DLS/SLS-Workflow ermöglicht es, Dutzende von Formulierungen, Puffern oder Kandidatenmolekülen nebeneinander unter identischen Bedingungen in einem einzigen Lauf zu vergleichen.

Diese Breite ist besonders in der frühen Entwicklung wichtig, wenn es nicht darum geht, ein einzelnes Molekül vollständig zu charakterisieren, sondern viele zu vergleichen und zu priorisieren. Robuste, vergleichbare Datensätze in dieser Phase zu erzeugen — statt tiefgehender, aber enger Daten für nur wenige Bedingungen — gibt Teams aus Formulierungsentwicklung und Kandidatenauswahl eine deutlich solidere Entscheidungsgrundlage. Schnellere Screenings bedeuten, dass diese Entscheidungen früher getroffen werden, mit weniger Ressourcen für Kandidaten oder Bedingungen, die ohnehin nie funktioniert hätten. Der Nettoeffekt ist genau das, worauf jedes Biologics-Programm abzielt: kürzere Entwicklungszeiten und Material- sowie Gerätezeit dort einsetzen, wo sie den größten Nutzen bringt.

Anwendungen in Biologika

Formulierungsentwicklung. Das parallele Screening von Hilfsstoffen, Puffern, pH-Wert und Ionenstärke gegen T_m und T_agg ermöglicht es Formulierern, schnell Bedingungen zu identifizieren, die ein Molekül sowohl vor Entfaltung als auch vor Aggregation schützen — nicht nur vor dem einen oder dem anderen.

Kandidatenscreening. Wenn mehrere Kandidatenvarianten oder Mutanten zur Auswahl stehen, ist die thermische Stabilitätsprofilierung eine der schnellsten Methoden zur Priorisierung und zeigt, welche Kandidaten am wenigsten wahrscheinlich später Probleme bei Herstellbarkeit oder Stabilität verursachen.

Stabilitätsstudien. Stabilitätsstudien kombinieren Entfaltungs- und Aggregationsverhalten, um ein Risikoprofil eines Moleküls unter thermischer Belastung zu erstellen. Das Verfolgen von T_onset, T_m, T_agg und B₂₂ über verschiedene Kandidatenformulierungen oder Lagerbedingungen hinweg zeigt nicht nur, wo ein Protein beginnt, seine Struktur zu verlieren, sondern auch, ob dieser Strukturverlust in Selbstassoziation übergeht — die Kombination, die nötig ist, um aggregationsanfällige Bedingungen zu identifizieren, bevor sie später in der Entwicklung sichtbar werden.

Mehr Erkenntnis bei geringerem Aufwand. Über alle drei Anwendungsfälle hinweg liegt der Reiz der Kombination von hochdurchsatzfähiger intrinsischer DSF mit hochdurchsatzfähigem DLS/SLS in denselben Vorteilen: reichhaltigere, besser korrelierte Daten, mit weniger Probe und in kürzerer Zeit als bei getrennter Durchführung der entsprechenden Techniken.

Fazit

Thermisches Entfalten ist eine der informationsreichsten Methoden, um die Protein-Stabilität zu untersuchen — aber nur, wenn man das Gesamtbild betrachtet. Die Kombination aus intrinsischer DSF und hochdurchsatzfähigem DLS erfasst konformationelle Veränderungen und Aggregationsverhalten nebeneinander, aus derselben Probe und auf demselben thermischen Rampenverlauf. Der praktische Vorteil liegt auf der Hand: geringerer Probenverbrauch, schnellere Screenings über Formulierungen oder Kandidaten hinweg und mehr Vertrauen in die Stabilitätsdaten, die einer Formulierungs- oder Molekülauswahlentscheidung zugrunde liegen.

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Referenzen

1. Leuenberger P, Ganscha S, Kahraman A, et al. Cell-wide analysis of protein thermal unfolding reveals determinants of thermostability. Science. 2017;355(6327):eaai7825. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aai7825
2. Llowarch P, Usselmann L, Ivanov D, Holdgate GA. Thermal unfolding methods in drug discovery. Biophysics Reviews. 2023;4(2):021305. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10903397/
3. Lang BE, Cole KD. Measurement of the Thermal Unfolding of Proteins by Differential Scanning Calorimetry and Fluorescent Reporter Dyes. National Institute of Standards and Technology. https://www.nist.gov/publications/measurement-thermal-unfolding-proteins-differential-scanning-calorimetry-and
4. Thompson A. Employing thermal protein unfolding to search for new drugs. Scilight. 2023;2023(20):201108. https://pubs.aip.org/aip/sci/article/2023/20/201108/2890803/Employing-thermal-protein-unfolding-to-search-for

Weiterführende Lektüre

• Thermisches Entfalten von Proteinen: Prinzipien, Methoden und Anwendungen – Was ist thermisches Entfalten?
• Stabilitätsrisiken entschärfen, bevor sie zum Problem werden
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