Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF)
Schnelle Einblicke in die Proteinstabilität, die Formulierung und die biomolekularen Wechselwirkungen
Schnelle Einblicke in die Proteinstabilität, die Formulierung und die biomolekularen Wechselwirkungen
Die Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF) wird genutzt, um die Konformationsstabilität von Proteinen zu beurteilen, indem Veränderungen der Fluoreszenz verfolgt werden, während eine Probe einer kontrollierten thermischen Belastung ausgesetzt wird. Mit steigender Temperatur zerstört die thermische Energie die native dreidimensionale Struktur des Proteins, wodurch innere Bereiche freigelegt werden, die zuvor im hydrophoben Kern verborgen waren.
Bei der herkömmlichen extrinsischen DSF wird diese strukturelle Entfaltung mithilfe von externen Reporterfarbstoffen erkannt, die sich an die neu freigelegten hydrophoben Bereiche binden. Die markierungsfreie intrinsische DSF-Methode basiert auf der natürlichen Fluoreszenz aromatischer Aminosäuren innerhalb des Proteins, wie Tryptophan. Während sich die Probe entfaltet, wechselt die aromatische Aminosäure von einer verborgenen, unpolaren Umgebung in eine exponierte, polare Umgebung, wodurch sich das natürliche Fluoreszenzemissionsspektrum des Proteins verändert.
Die intrinsische Differential-Scanning-Fluorimetrie basiert auf der Aminosäure Tryptophan, die UV-Licht bei 280 nm absorbiert und Fluoreszenz zwischen 300 nm und 400 nm emittiert.
In einem nativen, gefalteten Protein befinden sich Tryptophanrückstände typischerweise im hydrophoben Kern und emittieren Licht mit einem Spitzenwert von etwa 330 nm. Da thermische Belastung das Protein zur Entfaltung zwingt, werden diese verborgenen Aminosäurerückstände der umgebenden polaren wässrigen Umgebung ausgesetzt, was zu einer Verschiebung des Emissionsspektrums in Richtung 350 nm führt.
Durch die Aufzeichnung des Verhältnisses dieser beiden Emissionswellenlängen (F350/F330) über eine kontrollierte Temperaturrampe hinweg erstellt das System eine sigmoide thermische Entfaltungskurve. Die mathematische Analyse dieser Kurve zeigt den Beginn der Entfaltung (Ton) und die mittlere Schmelztemperatur (Tm), wenn sich 50 % der Proteinpopulation entfaltet haben.
Da ein höherer Tm-Wert eine größere Beständigkeit gegenüber hitzebedingter Denaturierung widerspiegelt, ermöglicht DSF den Forschern, Molekülkandidaten schnell einzustufen, Pufferbedingungen zu prüfen und die Stabilität der Kandidaten über die gesamte Arzneimittelentwicklungspipeline hinweg zu bewerten.
Darüber hinaus ermöglicht die intrinsische DSF in Kombination mit Lichtstreuungsverfahren (wie der statischen oder dynamischen Lichtstreuung) die Unterscheidung zwischen konformationeller Entfaltung und physikalischer Aggregation und liefert somit ein umfassendes Stabilitätsprofil eines Proteins in Lösung.
Die Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF) misst die thermische Stabilität von Proteinen, indem sie Konformationsänderungen bei steigender Temperatur überwacht. Der Unterschied zwischen extrinsischer und intrinsischer DSF lässt sich daran festmachen, ob ein Reporterfarbstoff hinzugefügt wird oder nicht.
| Funktion | Extrinsische DSF | Intrinsische DSF |
|---|---|---|
| Mechanismus | Nutzt einen zugesetzten Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYPRO Orange), der sich während der Entfaltung an freiliegende hydrophobe Bereiche bindet. | Eine markierungsfreie Methode zur Erfassung von Veränderungen der nativen Fluoreszenz aromatischer Aminosäuren (Trp/Tyr). |
| Probenvorbereitung | Erfordert Zugabe und Optimierung von Farbstoff. | Keine Markierung; misst Proteine in ihrem nativen Puffer. |
Grenzen der extrinsischen DSF:
Grenzen der intrinsischen DSF:
Biophysikalisches Screening der nächsten Generation im großen Maßstab
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