Los virus y sus derivados tienen muchas aplicaciones en biomedicina, bio y nanotecnología. En la genoterapia, los virus se usan como vectores para entregar genes modificados a las células objetivo, para tratar o prevenir una enfermedad mediante: 

  • El reemplazo de un gen mutado que provoca una enfermedad con una copia sana del gen
  • La desactivación o "eliminación" de un gen mutado que está funcionando incorrectamente
  • La introducción de un nuevo gen en el cuerpo para ayudar a combatir una enfermedad o tratar un síndrome


Los adenovirus, los retrovirus, los lentivirus, los virus adenoasociados (AAV) y otros virus animales se han utilizado para el desarrollo de terapias genéticas durante varias décadas. En los últimos años, esta área de aplicación ha experimentado un crecimiento significativo, en gran medida debido a los desarrollos en la ingeniería vectorial recombinante de AAV y la producción de genoterapias in vivo.

Se deben abordar varios desafíos para poder desarrollar vectores de genoterapia eficaces, que se elaboran a través de procesos de fabricación controlados y económicos.  Estos varían en aspectos como el diseño del cápside, la identificación de condiciones óptimas de los procesos y la formulación, y el control de calidad integral de las sustancias farmacéuticas y de los productos farmacéuticos. 

Aplicación de soluciones analíticas Malvern en todo el flujo de trabajo del desarrollo de la genoterapia in vivo

Con el diseño del cápside, la optimización de las condiciones de los procesos posteriores, las pruebas de formulación y estabilidad y la caracterización ampliada de productos y sustancias farmacéuticas, las tecnologías como la dispersión de luz dinámica (DLS), la dispersión de luz electroforética (ELS), la dispersión de luz dinámica de ángulo múltiple (MADLS), la cromatografía de exclusión molecular-dispersión de luz dinámica de ángulo múltiple (SEC-MALS), el análisis de rastreo de nanopartículas (NTA), la calorimetría isoterma de titulación y la calorimetría de barrido diferencial se utilizan para informar a los científicos sobre los atributos analíticos y de calidad de los vectores virales, lo que permite la caracterización, la comparación y la optimización de:

  • El tamaño del cápside (DLS, SEC, NTA)
  • El título del cápside o recuento de partículas (MADLS, SEC, NTA)
  • El porcentaje de partículas de virus que contienen genoma o el % de análisis completo (SEC
  • La formación de cúmulos (DLS, MADLS, SEC, NTA)
  • La fragmentación (SEC)
  • La estabilidad térmica (DLS, DSC)
  • El análisis de estructura de orden superior (DSC)
  • La identificación del serotipo (DSC)
  • El cápside sin recubrimiento y la eyección del genoma (DLS y DSC)
  • La unión al receptor (ITC)
  • El cargo (ELS)


Las técnicas DLS, MADLS, SEC-ALS, NTA, ITC y DSC son técnicas biofísicas sin etiquetas que requieren un desarrollo mínimo de los ensayos y se pueden aplicar fácilmente en todas las etapas, lo que fortalece el flujo de trabajo analítico para el desarrollo de la genoterapia.

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Tecnologías destacadas

Investigación y desarrollo temprano: diseño de cápside viral

Aunque el proceso de descubrimiento de la genoterapia es más corto que el observado normalmente en el descubrimiento tradicional de fármacos, el alto grado de complejidad del producto introduce desafíos adicionales que deben abordarse desde el principio para asegurar la entrega de productos seguros y eficaces. Entre estos desafíos se encuentran:

  • Selección de un cápside viral basado en propiedades óptimas y función
  • Ingeniería racional en proteínas para mejorar y modificar las propiedades y funcionalidades del cápside viral original


Las soluciones en ambos casos se basan en un conjunto integral de datos físico-químicos, bioquímicos y biológicos que informan el rendimiento del vector viral y vuelven a ingresar en el proceso de selección. 

En esta etapa, la extensa caracterización biofísica de los cápsides y de los vectores virales diseñados mediante el uso de DLS, MADLS, SEC-MALS, ITC y DSC admite la evaluación confiable de métricas de calidad importantes e interpretación de los resultados de los ensayos bioquímicos y biológicos a través de mediciones de tamaño y título del cápside, formación de cúmulos, el porcentaje de medición completa, la unión de receptores, la estabilidad térmica y la tendencia al retiro del recubrimiento del cápside.

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Desarrollo del proceso de genoterapia

El proceso de producción de la genoterapia debe cumplir con requisitos reglamentarios estrictos y otras expectativas internas sobre la calidad, los plazos y los costos. Las soluciones adecuadas son necesarias para apoyar y fortalecer el flujo de trabajo analítico y responder a los desafíos relacionados con: 

  • Alto grado de complejidad del producto
  • Diversidad de vectores virales para la entrega de genes en el diseño y desarrollo 
  • Procesamiento posterior no óptimo debido a ensayos analíticos extensos que sufrieron de una variabilidad importante


Durante todo el proceso posterior de purificación, se realizan varios ensayos para determinar los atributos analíticos clave que determinan la producción e informan sobre los atributos de calidad críticos (CQA), como la pureza, la potencia, la estabilidad y la seguridad del vector viral.  Normalmente, estos parámetros son, entre otros, los siguientes:

  • Título de cápside o recuento de partículas
  • Recuento genómico
  • Porcentaje de partículas de virus que contienen genoma o % del análisis completo
  • Caracterización serotípica
  • Formación de cúmulos 
  • Contaminación por proteínas de células huésped y nucleótidos no deseados 


Los primeros tres parámetros (título de cápside, recuento genómico, % del análisis completo) se miden comúnmente mediante dos o más de los siguientes ensayos: qPCR, ddPCR, ELISA, AUC, HPLC-AEX o TEM.  Cada método tiene fortalezas y debilidades intrínsecas relacionadas con el parámetro medido, el rendimiento, la velocidad, la exactitud y los requisitos de volumen de muestra. 

Genoterapia: caracterizar, comparar, optimizar

En el desarrollo de procesos para vectores virales como AAVs, el Zetasizer Ultra se ajusta bien como un ensayo complementario que se puede utilizar en flujos de trabajo analíticos existentes y proporciona una medición rápida, sin etiquetas, no destructiva, de bajo volumen y ortogonal de la concentración total de partículas virales, el título del cápside, el tamaño del cápside, la carga, la formación de cúmulos, la estabilidad térmica y el retiro del recubrimiento del cápside.

Un análisis exacto y preciso del tamaño es esencial para la medición de la concentración de partículas. El Zetasizer Ultra utiliza tres ángulos de dispersión para proporcionar una medición más precisa y de mayor resolución. En la dispersión de luz dinámica de ángulo múltiple (MADLS), se recopila la información de dispersión de los ángulos posteriores laterales y delanteros y se combinan en una distribución única de mayor resolución que proporciona datos más representativos.

La cromatografía de exclusión molecular (SEC) se ha utilizado desde hace mucho como una herramienta clave para medir el peso molecular de macromoléculas, proteínas, virus, polisacáridos y polímeros. OMNISEC, un sistema SEC de detección múltiple, puede proporcionar datos sobre varios atributos clave analíticos y de calidad de los AAV, como el título de cápside y genómico, así como el % completo. Solo se puede acceder a ellos mediante detección UV. Estos parámetros importantes proporcionan información vital sobre la pureza, la potencia y la estabilidad de los vectores virales.

La calorimetría de barrido diferencial (DSC) es una herramienta consolidada para la caracterización y el desarrollo de productos basados en virus, incluidas varias vacunas comerciales. Además de las diversas métricas de estabilidad para los vectores virales, la DSC ofrece un método de prueba de la desintegración del cápside que es característica de una ID serotípica, este esquematiza la estabilidad térmica y las huellas digitales con estructura de orden superior, y puede detectar cambios estructurales en respuesta a cambios de tensión, formulación o condiciones de proceso.

La estabilidad y la función del cápside viral están bloqueadas en un buen equilibrio. Los cápsides virales deben ser lo suficientemente estables para contener y proteger al genoma, unirse a la superficie de la célula huésped para la absorción celular y navegar por el entorno celular. Sin embargo, un cápside viral también debe ofrecer la labilidad conformacional suficiente para liberar el genoma en el sitio de replicación.

Poco se entiende sobre el mecanismo de recubrimiento del vector AAV, pero parece que se requiere un cambio estructural para el cápside sin recubrimiento y la liberación del genoma.  La tendencia del vector viral sin recubrimiento se postula para correlacionarse con un atributo importante de calidad: contagiosidad. La DSC, junto con las rampas térmicas de dispersión de luz dinámica se puede utilizar para evaluar la propensión sin recubrimiento de un cápside viral en respuesta a condiciones de amortiguación y estrés.

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