por Verna Frasca, Tuesday, 19th March 2019

Mejores prácticas para la Calorimetría de Titración Isotérmica para estudiar interacciones de unión – Parte 3

Mejores prácticas para la Calorimetría de Titración Isotérmica para estudiar interacciones de unión – Parte 3

A continuación, se presentan varias mejores prácticas para realizar experimentos tradicionales de unión con los sistemas MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC e iTC200. Esta es una continuación de los blogs anteriores ‘Mejores prácticas para la Calorimetría de Titración Isotérmica para estudiar interacciones de unión’ parte 1 y parte 2.

Realizar controles regulares de rendimiento y validación en su ITC

  • Inyecciones de agua en agua
  • Kit de prueba ITC con RNasa y EDTA
  • Otro ensayo de unión de referencia

Antes de los experimentos de unión, realice titulaciones de control siempre que sea posible

  • Verifique los calores de dilución y otras fuentes de cambio de calor
  • La típica titulación de control es el ligando en la jeringa de ITC, titulado en un tampón coincidente, utilizando los mismos parámetros experimentales de ITC que el experimento de unión
  • Los cambios de calor para la titulación de control deben ser pequeños, reproducibles y similares a los cambios de calor al final del experimento de unión (Figura 1, arriba)
  • Otras titulaciones de control son tampón en tampón y tampón en macromolécula en la celda de ITC


Figura 1: (arriba) Datos crudos de ITC, con la titulación de control (ligando en tampón) (rojo) y el experimento de unión (ligando en macromolécula) (negro). Note que los picos para la titulación de control son similares en forma y tamaño a las inyecciones finales del experimento de unión.

(Abajo) Cambios de calor normalizados, con la titulación de control (rojo) y el experimento de unión (negro). Los datos se ajustan al modelo de unión de un conjunto de sitios.

Evaluación de datos crudos de ITC: ¿cómo se ven los datos crudos para un experimento ideal de ITC para un evento de unión (1:1)?

Ver figuras 1 y 2.

  • El gráfico de datos de titulación comienza como una serie de picos grandes, aproximadamente iguales (exotérmicos o endotérmicos), representando cerca del 100% de unión del ligando a la macromolécula
  • Los cambios de calor se reducen a medida que los sitios de unión se saturan con más inyecciones de ligando durante el experimento
  • Los picos finales, correspondientes a los calores de dilución del ligando después de que la unión está completamente saturada, deben ser pequeños y reproducibles (Figuras 1 y 2)
  • Este tipo de curva de titulación dará lugar a una isoterma de unión sigmoidal (Figura 1 abajo)
  • Se necesita un cambio de calor suficiente por encima del ruido de fondo para obtener datos de ITC de alta calidad
  • Calores de inyección (área integrada):
    • Para PEAQ-ITC y ITC200: >2.5 ucals para el segundo pico (primera inyección completa) es ideal
      • ~1 ucals para el segundo pico es el calor mínimo para análisis de datos
    • Para VP-ITC: >10 ucals para el segundo pico (primera inyección completa) es ideal
      • ~3-5 ucals para el segundo pico es el calor mínimo para análisis de datos
    • Por debajo de este rango de detección de calor, los datos pueden ser más ruidosos debido a la menor relación señal/ruido
  • La posición de la línea base (en ucal/sec) para los datos crudos de ITC debe estar dentro de 1 ucal/sec de la configuración de potencia de referencia. Si la diferencia es mayor a 1 ucal/sec, eso puede indicar una celda ITC sucia y/o burbujas en la celda de referencia o muestra
  • Todos los valores de DP (eje Y) para los datos crudos de ITC deben estar por encima de 0 ucal/sec
  • La posición de la línea base posterior a la inyección debe ser la misma que la línea base antes de la inyección. Si no, puede que no haya suficiente tiempo entre inyecciones, o hay otro proceso causando un cambio en DP como la hidrólisis enzimática
  • Un leve desplazamiento en la línea base durante la titulación es normal. Si la línea base de integración es buena, los datos están bien (Figura 2). No se desean grandes saltos en la línea base, o «escalones».

Figura 2. Datos ITC de alta calidad. Obsérvese el leve desplazamiento en la línea base de integración (en rojo): esto es aceptable.

Más información sobre el valor N del ajuste de curvas ITC

N está asociado con la concentración total de macromoléculas y es uno de los parámetros que se determina durante el análisis de datos. Es importante entender que el valor N de ITC NO siempre es lo mismo que la estequiometría (relación de unión) del ligando a la macromolécula. El valor N equivale de hecho a la estequiometría si las concentraciones que usamos para el ajuste son correctas y 100% activas.

Otra forma de expresar el valor N es esta ecuación:

N = St x [AFcell/AFsyr]

Donde St es la estequiometría (número de sitios de unión que la macromolécula tiene para el ligando), AF es la «fracción activa» de la biomolécula (la concentración activa dividida por la concentración total), AFcell es la fracción activa de la muestra en la celda (típicamente la macromolécula), y AFsyr es la fracción activa de la muestra en la jeringa (típicamente el ligando).

Cualquiera de los tres valores en esta ecuación puede cambiar N, lo que significa que N es una medida de la relación de unión tanto como de la actividad de la(s) muestra(s). Se deben conocer (o asumir) dos de estos valores para obtener el tercero. Por ejemplo, si uno está interesado en la estequiometría, entonces las concentraciones proporcionadas en el ajuste deben ser precisas y 100% activas. Si uno está interesado en la actividad de la muestra en la celda (a menudo la macromolécula), entonces se deben asumir la estequiometría y la concentración activa de la muestra en la jeringa (ligando).

En el paquete de software de análisis de datos PEAQ-ITC, también se pueden ajustar los datos fijando N a 1 (o el valor deseado) y variando la concentración en la celda o la jeringa.

Si N es menor que la estequiometría esperada, su concentración activa de macromolécula en la celda es menor a la concentración total, y/o su concentración activa de ligando es mayor que la concentración total.

Si N es 0,5, es posible que su macromolécula (en la celda ITC) sea un dímero y se une un ligando por dímero. También es posible que su biomolécula en la jeringa tenga 2 sitios de unión, y la muestra en la celda tenga un sitio de unión, por lo que debería intentar ajustar la curva de unión usando la opción «ligando en celda».

Si N es mayor que la estequiometría esperada, su concentración activa de macromolécula en la celda es mayor a la concentración total, y/o su concentración activa de ligando es menor que la concentración total.

Los errores en la concentración del ligando en la jeringa resultan en errores de medidas de N, KD y ΔH, y por lo tanto la energía libre calculada (ΔG) y la contribución entrópica (-TΔS) a la unión. Los errores en la concentración de macromolécula en la celda afectan principalmente la precisión del valor de N determinado.

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