Buenas prácticas para la calorimetría de titulación isotérmica en el estudio de interacciones de unión – Parte 4

por Verna Frasca, Thursday, 18th April 2019

Aquí hay varias buenas prácticas para realizar experimentos tradicionales de unión con los sistemas MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC y iTC200. Esta es una continuación de blogs anteriores ‘Buenas prácticas para la calorimetría de titulación isotérmica en el estudio de interacciones de unión’ parte 1, parte 2 y parte 3.

Problemas comunes con los datos brutos de ITC y posibles causas

  • Altos calores de inyección, debido a grandes calores de dilución:

    • Esto se debe típicamente a una desajuste entre las soluciones de macromolécula y ligando, que es mucho mayor que el calor de unión real.
    • La isotermia de unión a menudo se asemeja a una línea recta, sin evidencia de saturación de unión.
    • Normalmente, este gran cambio de calor no puede corregirse con la sustracción de una titulación de control.

  • La DP no vuelve a la línea base preinyección antes de la siguiente inyección.

    • Esto puede deberse a un tiempo insuficiente entre inyecciones para permitir la medición completa del calor de unión.
    • No se mide todo el cambio de calor por inyección, afectando la calidad de los datos. Ajuste el volumen de inyección, reduzca la concentración de ligando y/o tenga más tiempo entre inyecciones.
    • Si nota este efecto durante el experimento, puede aumentar el intervalo entre inyecciones para las inyecciones restantes.
    • También puede haber otro proceso (más lento) que cause un cambio de calor, como los cambios conformacionales.

  • Picos en las inyecciones, algunos picos son mucho mayores (o mucho menores) que otros:

    • Causados por burbujas en la celda ITC y/o jeringa, o una punta del émbolo sucia o dañada en el inyector ITC.

  • Línea base ruidosa y/o picos entre inyecciones:

    • Burbujas de aire debido a un llenado deficiente de celda y/o jeringa, celdas y/o jeringa sucias.
    • También puede ser debido a una aguja de inyección doblada o un problema con el sistema de inyección.

  • Línea base escalonada: hay un cambio en la capacidad térmica del sistema, debido a la hidrólisis enzimática, pH o desajuste de buffer:

    • Si se estudia la unión entre sustrato y enzima, use un sustrato no hidrolizable.
    • La línea base escalonada también puede ser debido a burbujas en la celda o jeringa ITC, debido a un llenado insuficiente.

  • Calor de unión no detectable:

    • No hay unión.
    • Es posible que la unión esté ocurriendo, y el cambio de calor sea demasiado bajo. La entalpía de unión puede ser menor de lo esperado y/o la afinidad de unión puede ser más débil de lo esperado.
    • Para aumentar el cambio de calor/inyección, necesita aumentar la concentración de macromolécula y/o ligando; aumentar el volumen de inyección y/o cambiar la condición experimental, como la temperatura experimental o el buffer/pH.

Corregir el calor de dilución, antes del análisis de datos

  • Como se discutió en blogs anteriores, una estrecha coincidencia de las soluciones de macromolécula y ligando es esencial para evitar grandes calores de dilución que podrían enmascarar la señal de unión real. Estos calores no relacionados con la unión deben restarse de cada uno de los puntos en la isotermia de unión de titulación de macromolécula-ligando antes de un análisis de datos más detallado. Esto puede lograrse de varias maneras:
  • Una estimación del calor de dilución puede obtenerse directamente de la titulación experimental promediando los calores integrados asociados con las últimas inyecciones. Esta sustracción puede realizarse usando la opción «Matemáticas simples» en el análisis de datos de Origin. Este método asume que los sitios de unión han sido completamente saturados con ligando al final del experimento ITC.
  • Para PEAQ-ITC, también se puede usar la opción «desplazamiento ajustado» durante el análisis de datos para corregir el calor de dilución.
    • Si tiene una titulación de control de solución de ligando en buffer, puede realizar una sustracción punto por punto de los valores de pico integrados de este control a partir de los del experimento. Para calores de unión pequeños, esta corrección podría resultar en una isotermia de unión más ruidosa, en comparación con una sustracción constante.
  • Tenga en cuenta que la titulación de control debería resultar en calores reproducibles de inyección a lo largo de la titulación y resultar en un gráfico lineal sin o con una pendiente suave (Figura 1).
  • En lugar de una corrección punto por punto, puede crear una línea, o obtener un cambio de calor medio de inyección para la titulación de control y restarlo de los datos experimentales.
  • Si las últimas inyecciones de la curva de unión experimental tienen una pendiente no nula, y/o la titulación de control no es lineal o tiene una gran pendiente, debe considerar las posibles razones de tales resultados y si se puede corregir adecuadamente.
  • Después de tener en cuenta los calores de dilución mediante alguno de estos enfoques, la entalpía de unión en saturación debería acercarse a cero y la isotermia de unión puede ajustarse utilizando un modelo apropiado para determinar los parámetros de unión.

Figura 1: Datos brutos de ITC, con la titulación de control (ligando en buffer) (rojo), y el experimento de unión (ligando en macromolécula) (negro). Note que los picos para la titulación de control son similares en forma y tamaño a las inyecciones finales del experimento de unión.

Figura 1: Cambios de calor normalizados, con la titulación de control (rojo), y el experimento de unión (negro). Los datos están ajustados al modelo de unión de un conjunto de sitios.

Optimización de experimentos ITC, después de los primeros experimentos

  • Es posible cambiar y modificar la forma de la isotermia de unión ajustando la concentración de la muestra de celda y/o la muestra de jeringa para optimizar la calidad de los datos obtenidos. También puede cambiar el volumen de inyección y el número de inyecciones. Si tiene datos preliminares, puede usar las opciones avanzadas del asistente «Diseñar Experimento» o otra herramienta de simulación de datos de ITC para simular isotermias de unión y diseñar futuros experimentos.
  • Es posible que no pueda usar la(s) concentración(es) «óptima(s)» para su unión: concentraciones muy bajas de reactivos podrían resultar en una señal experimental demasiado pequeña (que depende de ΔH de unión), mientras que concentraciones muy altas podrían simplemente ser poco prácticas o imposibles de lograr para biopolímeros (ej. si una proteína tiende a agregarse en alta concentración).
  • Si no puede conseguir que la concentración de ligando sea lo suficientemente alta para lograr la saturación de unión después de la inyección del contenido del volumen de la jeringa, puede mantener el complejo macromolécula-ligando en la celda ITC, llenar la jeringa con más ligando y realizar un segundo experimento de titulación. Esto puede repetirse hasta que se alcance la saturación de unión.
  • ¿Qué sucede si la afinidad de unión y la concentración de macromolécula resultan en un valor C fuera del rango óptimo? Para reacciones de unión muy fuerte (donde las condiciones de C> 1000 son probables) solo ΔH y N pueden determinarse con precisión directamente de un experimento ITC. Enfoques adicionales, como el uso de un experimento de desplazamiento/competencia con un ligando de unión débil preestablecido, pueden sin embargo permitir al usuario determinar un KD.
  • Para eventos de unión débil, puede ser aún posible obtener datos útiles trabajando en el «rango bajo C» (C valores por debajo de 1-5) usando una concentración muy alta de ligando para dirigir la unión hacia cerca de la saturación al final de la titulación. En este escenario, las isotermias de unión tienden a no ser sigmoides y pueden requerir fijar N durante el ajuste, de modo que solo la afinidad de unión puede medirse con confianza. ΔH no estará bien definido por el experimento. Sin embargo, en casos donde N se conoce con confianza y puede fijarse en el procedimiento de ajuste si es necesario, tales experimentos pueden ser aún muy informativos. También puede realizar un experimento de desplazamiento/competitivo diseñado para caracterizar uniones débiles.

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