DSCとタンパク質の安定性: エンタルピー変化は何を意味するのか？

示差走査熱量測定 (DSC) は、タンパク質、核酸、その他のバイオポリマーの熱変性などの熱変化のエンタルピー変化 （∆H）を直接測定する唯一の分析方法です。

∆Hとは何か？

∆Hは、定圧でシステムを温度Tまで上昇させるために吸収される全エネルギーを指します。タンパク質の場合、これはそれを展開するために使われるエネルギー（熱）を意味し、∆Hは正の値を取り、吸熱プロセスを表します。このエネルギーは、タンパク質を折りたたんだ形状に保つためのすべての原子と分子の運動、および結合のエネルギーに関連しています。

∆Hはサーモグラムの下の面積を積分することで計算され、タンパク質1モルあたりカロリー（またはジュール）で表されます。DSC実験中にタンパク質が高温にさらされると、タンパク質は熱変性を始め、非共有結合が破壊されます。∆Hは、タンパク質をその天然（折りたたまれた）形状に保つために必要な結合の数に関連しています。

∆Hは、総タンパク質濃度をどれだけ正確に測定するかに依存します。タンパク質濃度が正確に測定されていない場合、計算された∆H値に影響が出ます。

実際に∆H値は何を伝えるのか？

異なるタンパク質のDSC結果を比較する際、∆H値が大きいタンパク質が必ずしも∆Hが小さいタンパク質よりも安定しているとは限りません。∆Hは総モル濃度で正規化されるため、その値はしばしばタンパク質の大きさに比例します。ほとんどのタンパク質は、結合密度（結合/体積）が同じです。したがって、分子量が大きいタンパク質は∆Hも大きいと考えられます。

∆Hは溶液中の天然タンパク質の割合に依存する

重要な点として、DSCは折りたたまれた（天然）形状をとるタンパク質の∆H値のみを測定するということがあります。∆Hの大きさは折りたたまれた割合の濃度に依存します。初期の折りたたまれたタンパク質割合が総タンパク質濃度の100％未満である場合、計算された∆H値もそれに応じて小さくなります。

下図は、保存中に異なる時間で測定された同じタンパク質のDSCサーモグラムを示しています。青いサーモグラムは、新しく調製されたタンパク質で、100％の天然（折りたたまれた）タンパク質です。タンパク質サンプルが保存中に劣化すると、溶液中の天然タンパク質の割合が減少し、その結果、DSCサーモグラムのエンタルピーが減少し始めます。異なるサーモグラムの相対∆H値を使用して、100％天然タンパク質の基準DSCサーモグラムがある場合、各サンプルの折りたたまれたタンパク質割合を見積もることができます。

この例では、緑のサーモグラムを持つサンプルの∆Hは青いサンプルの50％であり、50％の折りたたまれたタンパク質です。オレンジのサンプルは25％の折りたたまれたタンパク質を持ち、赤いサンプルは青いサーモグラムに対して10％の折りたたまれたタンパク質を持っています。

熱量的およびファントホッフのエンタルピー

これまでこのブログでは、DSCによって直接測定され、多くの場合∆H_cal と表現される「熱量的」エンタルピーについて書かれてきました。DSCデータから計算できる他のタイプのエンタルピーがあり、それがファントホッフのエンタルピー、∆H_vHです。この値はDSC非二状態モデルフィットから入手可能です。∆H_vH はまた、円偏光二色性など、いかなる非熱量的方法（間接的）で決定されるエンタルピーです。

DSCでは、∆H_cal は遷移ピークの下の領域のみによって決定され、一方で∆H_vH は遷移ピークの形状によってのみ決定されます。遷移が鋭ければ鋭いほど、∆H_vH は大きくなり、逆もまた同様です。∆H_cal は濃度依存的ですが、H_vH はそうではありません。

通常、∆H_cal /∆H_vH の比率が1であることは、研究中の遷移が二状態の展開メカニズムに適合しているということを示します。∆H_cal /∆H_vH の比率が1より大きい場合は、有意に占める中間体が存在することを示し、∆H_cal /∆H_vH の比率が1より小さい場合は、分子間相互作用を示します。

∆H_cal /∆H_vH を使用することで、タンパク質の大部分が不活性であることを推定できます。シンプルな単一ドメインタンパク質を持ち、中間体がないと仮定する場合、展開は∆H_cal /∆H_vH の比率が1からそれほど遠くないことが期待されます。 ∆H_calが∆H_vH よりも著しく低い場合、大部分のタンパク質がすでに不活性であることを示しているかもしれません。

要約すると、∆HデータのDSC分析は、タンパク質の展開メカニズムとどれだけのタンパク質がその天然構造にあるかについての洞察を提供することができます。

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