粒子特性分析に関する基本ガイド-4

技術 2: 動的光散乱 

  フォトン相関分光法(Photon Correlation Spectroscopy, PCS)または準弾性光散乱(Quasi-Elastic Light Scattering, QELS)とも呼ばれる動的光散乱(Dynamic light scattering, DLS)は、通常1ミクロンから1ナノメートル以下の範囲の粒子および高分子のサイズを測定するための非侵襲的な(非侵襲的)よく確立された技術です。

  この技術を利用して、液体、たとえばタンパク質、ポリマー、ミセル(micelles)、炭水化物、ナノ粒子、コロイド分散およびエマルションなどの液体中に浮遊している粒子から成るサンプルを測定することができます。

主要な利点:
      • ナノサイズおよびバイオ素材に理想的な粒度範囲
      • 少量のサンプルが必要
      • 高速な分析および高スループット
      • 完全なサンプル回復が可能な非侵襲的技術

原理

  浮遊している粒子は、この浮遊粒子と溶媒分子との間に熱的に誘導された衝突によってブラウン運動(Brownian motion)をします。

  レーザーが粒子を照射している場合、散乱された光の強度は非常に短い時間尺度で急速に変動し、これは粒子のサイズに応じて異なり、小さな粒子ほど溶媒分子によってより遠くに移動され、急速に動くことになります。この強度の変動の分析は、ブラウン運動の速度を算出し、それに応じてストークス-アインシュタインの関係(Stokes-Einstein relationship)を使用して粒度を算出します。

  動的光散乱で測定される直径を流体力学的直径(hydrodynamic diameter)と呼び、粒子が流体中で拡散する様子を示しています。この技術で取得された直径は、測定される粒子と同じ並進拡散係数を持つ球形の直径です 

 

  ‘コア’直径より大きい、DLSを用いて記録された流体力学的直径に関する図示も並進拡散係数は粒子’コア’のサイズだけでなく任意の表面構造によって変化し、また媒質イオンの濃度と種類によっても異なる場合があります。これは電子顕微鏡で測定するよりもサイズが大きいことを意味し、たとえば粒子が元の環境から除去されることを意味します。

  動的光散乱は強度が重み付けされた粒度分布を算出し、これは巨大な粒子が粒度結果に支配的になる可能性があることを意味し、それを認識していることが重要です。

機器装置

  従来の動的光散乱装置は、レンズを使用してサンプルに焦点を合わせるレーザー光源で構成されています。

  光は粒子によってあらゆる角度に散乱され、伝統的にはレーザービームに対して90°の角度に配置される単一の検出器が散乱された光の強度を収集します。

  散乱された光の強度変動はデジタル相関器(Correlator)に供給される電気パルスに変換されます。これは粒度が計算される自己相関関数を生成します。

NIBS

  最新の装置では、NIBS(非侵襲的後方散乱, Non-Invasive Backscatter)技術は 測定可能な粒度の範囲とサンプルの濃度を拡張します。

  この装置のサイズ測定機能は下図のように173°で散乱された光を検出します。これは後方散乱検出として知られています。また、光学機器はサンプルと接触せず、したがって検出器を非侵襲的と呼びます。

  非侵襲的な後方散乱検出の利用における多くの利点が あります。
      • 感度が向上します。
      • より広範囲なサンプル濃度が測定可能です。 

      • サンプル準備が簡略化されます。 

(a)  小さい粒子または低濃度のサンプルに対しては、サンプルから散乱される量を最大化することが利点です。レーザーがキュベット(cuvette)壁を貫通するとき、空気とキュベット材料間の屈折率の差が’フレア(flare)’を引き起こします。このフレアは散乱された粒子からの信号に干渉する可能性があります。測定位置をキュベットの壁からキュベットの中央部に移動すると、これらの効果が除去されます。

(b)  巨大な粒子または高濃度のサンプルはより多くの光を散乱します。キュベットの壁により近い場所で測定することで、散乱された光が通過する経路の長さを最小化することで、多重散乱効果を減少させることができます。 

技術 3: 自動イメージング技術

  自動イメージング技術は約1ミクロンから数ミリメートルサイズの粒子の特性分析のための高解像度測定法です。

  個々の粒子イメージは分散サンプルからキャプチャされ分析され、その粒度、形状および他の物理特性が判断されます。一度の測定で数十個の粒子から数万個の粒子を測定することで、統計的に代表的な分布が構成されることがあります。

  静的イメージングシステムでは 分散サンプルが固定されている一方で、動的イメージングシステムでは サンプルがイメージキャプチャ光学機器を通過して移動します。この技術はしばしばサンプルについてより深い理解を求める、またはアンサンブルベースの測定を検証するために、レーザー回折などのアンサンブルベースの粒度測定方法と共に使用されます。一般的なアプリケーションは以下の通りです:

      •  粒度だけでは区別できない粒子の形状の違いを測定
      •  凝集体(agglomerate)、大きな粒子または汚染された粒子の検出および/または調査
      •  針状結晶のような非球形の粒子サイズ測定
      •  レーザー回折などのアンサンブルベースの粒度測定の検証

機器装置

  典型的な自動化イメージングシステムは3つの主要な要素で構成されています。

1. サンプル示演および分散
      この段階は良好な結果、すなわち視野中での個々の粒子および集合体の空間的分離という目標を得るために重要です。

      さまざまなサンプル示演方法はサンプルの種類および使用される測定方法に応じて変わることがあります。動的イメージング測定は測定中にサンプルが通過するフローセルを利用します。静的イメージング測定は、たとえば顕微鏡スライド、ガラス板またはフィルターメンブレン(filter membrane)などの平面を利用します。潜在的な測定者間の誤差（オペレーターのばらつき）を避けるためには自動化分散法が望ましいです。 

 

 

  

2. イメージキャプチャ光学機器

      個々の粒子のイメージは測定中のサンプルに適した光学レンズとデジタルccdカメラを用いてキャプチャされます。

      静的イメージングシステムがサンプル照射、たとえば反射投影(episcopic)照射、透過(diascopic)照射、暗視野(darkfi eld)照射などのサンプル照射面でより柔軟性を提供している一方で、動的イメージングシステムではサンプルは通常サンプルの背面から照射されます。

      また、結晶のような複屈折物質に対しては偏光機器(polarizing optics)を利用することができます。最も高度な動的イメージングシステムは非常に微細な粒子に対しても一定の焦点を維持するために流体力学的シース流れメカニズムを利用します。 

 

3. データ分析ソフトウェア

      一般的な装置はそれぞれの粒子に対してさまざまな形態学的特性(morphological properties)を測定し記録します。

      最も高度な装置にはソフトウェアに、グラフ化およびデータ分類オプションがあり、直感的な視覚インターフェースを介して関連データが測定値から可能な限り簡単に抽出されることができます。

      各々の粒子に対して個別に保存されたグレースケールイメージは量的結果の質的検証を提供します。 

 

 

技術4: 電気泳動散乱(ELS)

 電気泳動散乱(ELS)は分散状態の粒子または溶液に含まれる分子の電気泳動動度を測定するために使用される技術です。これらの動度は異なる実験条件下で物質を比較できるようにするためにしばしばゼータ電位に変換されます。

  基本的な物理学的原理は電気泳動法です。2つの電極があるセルに分散が適用されます。

  電極に電場が印加され任意の帯電した粒子または分子が反対に帯電した電極に移動します。任意の帯電した粒子または分子が移動する速度が電気泳動動度であり、それと該当する粒子または分子のゼータ電位に関連付けられます。