RhまたはRg: 私のGPC/SECサンプルに最適なのはどちら？

ゲル浸透クロマトグラフィー / サイズ排除クロマトグラフィー (GPC/SEC) を使用する主な目的は、しばしば高分子サンプルの分子量を決定することです。Malvern Panalytical社のマルチ検出器システム、OMNISEC や TDAmax システムのようなものは、他の分子的特性評価パラメータを提供することができます。例えば、分子サイズを含みます。タンパク質や分子量が既知の他のサンプルを分析する際のように、分子サイズだけが分析の目的となることもあります。このような場合、分子サイズはサンプルの分子構造についての重要な情報を明らかにします。この構造はしばしばサンプルの最終的な機能または用途に密接に関連しています。

GPC/SEC分析を通じて利用可能な分子サイズの一般的な測定には、動的半径 (Rh) と回転半径 (Rg) があります。タンパク質の特性評価におけるRhとRgの利用方法を説明した以前の投稿では、動的光散乱 (DLS) と 小角X線散乱 (SAXS) が引用されています。この投稿では、RhとRgの定義、GPC/SECコンテキストでの計算方法、その違いの実際の影響を検討します。ここで触れるトピックに関する詳細情報（そしてより多くの方程式！）については、これらの リンクされた ドキュメントを参照してください。

RhとRgの定義

深く数学に踏み込まずに説明すると、サンプルのRhは、分子量と固有粘度から計算されたサンプルの質量と密度を持つ理論的な球の半径です。Rgは、分子の構成要素の質量中心からの二乗平均平方根距離を表します。GPC/SEC分析によって生成された単一のRhおよびRgの数値は、各データスライスで計算された値を集約して得られる重量平均値です。重量平均分子量（Mw）に類似して、これらの値はサンプル全体を特徴づけるのに最も適しています。マルチアングル光散乱（MALS）検出器をGPC/SEC装置からバッチモードで分離して使用すると、z平均のRg値、Rgzが得られます。

RhとRgの計算方法

ここで少しだけ数学に触れます。球形粒子の溶液の粘度を表すアインシュタインのモデルに基づくと、Rh、分子量 (M)、固有粘度 ([η]) の間の関係は以下の通りです (N_Aはアボガドロ数です)。GPC/SECは直接的に分子量および固有粘度を各データスライスで計算するため、この方程式を使用してRhを簡単に決定できます。したがって、Rh計算の下限は、屈折率（RI）、光散乱、および粘度計チャネルで十分な検出器応答を得るための最小サンプルフラクションと一致します。

GPC/SECからRgを計算するためには、2つのオプションがあります。直接的で最も一般的な方法は、観測角度に対する散乱光強度の変化を観察することです。これは、サンプルの角度依存性を観察するために少なくとも2つの角度で光散乱検出器を必要とします。

RhとRgの以前の議論やより最近の光散乱検出器の記事で述べられているように、タンパク質のような10–15 nmより小さいタンパク質は等方散乱因子であり、つまりすべての方向に等しく光を散乱させるため、GPC/SECを用いてRgを決定するのは難しいです。低分子量ポリマーも等方散乱因子であり、その結果、部分ジムプロットは傾斜がゼロで平坦であり、これらの小さな材料のRgを決定できません。これは図1の左に描かれています。

Rgを光散乱によって計算するためには、分子が角度依存性を示さなければならず、これは観測角度に応じて散乱光の強度が変化することを意味します。これは、図1の右に示されている例によって示されているような傾斜のある部分ジムプロットをもたらします。光散乱検出器で使用する光の波長はサンプルが角度依存性を示すサイズのしきい値に影響し、光源の波長を調整することによってより小さなサイズ範囲にRgを計算することが可能です。

代替的なRgの計算方法は、以下のフロリー・フォックス方程式を使用することです。この方程式は、分子量 (M) および固有粘度 ([η]) をRg (Φ₀ を定数として取り扱う)に関連付けます。この方法でRgを計算する利点は、上記のRhのように、計算の下限がサンプルの角度依存性ではなく検出器応答に依存することです。欠点は、係数Φ₀が実際にはサンプル、溶媒、研究中の分子構造によって決定される（ランダムコイルに最も適している）ため、定数として設定すると近似のレベルを導入することです。一般的に、そしてこの投稿の残りの部分では、Rgは光散乱検出器によって計算されます。

RhとRgデータの違い

与えられた分析で利用可能なRhとRgのデータは、調査している特定のサンプルに依存します。Rgの計算には、分子が角度依存性を示す必要があるため、サンプルが角度依存性を示さない等方散乱因子である場合、Rgが決定されない可能性があります。分子量と分子サイズの分布が広いサンプルは、角度依存性を示す大きな部分と、示さない小さな部分を持つ可能性があり、Rgは早く流出する大きな分子についてのみ計算できます。

この挙動を強調する例は図2に示されています。RhとRgが直接計算されたデータ部分は、濃い緑とマゼンタのプロットの実線部分で表されています。破線部分は、RhとRgの値が外挿される領域を示しています。サンプルの最小のRg値は11.55 nmであり、これは後に溶出するサンプルのフラクションが角度依存性を示さないほど小さくなった時点を表しています。このため、サンプルの大部分のRgは外挿されます。これに対し、Rhは5.08 nmに渡って計算でき、サンプルの大部分の分子サイズを直接計算できます。

RhとRgはサンプルの異なる特性を表すため、結果として得られる値が同じではないと期待するべきではありません。これは一方が間違っているという意味ではありません！特定のサンプルタイプおよび溶媒に対して、両者の間に一貫した関係がある可能性があります。ポリマーサンプルを経験した中では（タンパク質についてのRgデータを得るのは難しいため）、計算されたRgは同じオーダーだが、決定されたRhよりも少し大きいことがよくあります（図2の例では、Rh = 13.62 nm; Rg = 14.19 nm）。これがすべての場合に当てはまる必要はありません。RhとRgの関係は分子構造に依存します。

分子サイズはさまざまな理由で科学者にとって重要です。利用可能なデータをサンプルに最も適した方法で使用することをお勧めします。そして次回、GPC/SECデータを提示するときに、RhとRgの違いについての質問を受けても、あなたは準備ができています！

以前のブログ:

• 私のGPC/SECクロマトグラムは信頼できるか?
• マルチ検出器GPC/SECはどのように機能するか?
• 組成分析にGPC/SECを使用する
• GPC/SECは私のサンプルが分岐しているかどうかを判断できるか?

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